NIST MS-search 2.0 PIKAOHJE

SPEKTRIKIRJASTON LUOMINEN NESTEKROMATOGRAFI- 

MASSASPEKTROMETRILLE 

Soja Leskinen 

Opinnäytetyö 

Syyskuu 2010 

Laboratorioalan koulutusohjelma 

Tampereen ammattikorkeakoulu

TIIVISTELMÄ 

Tampereen ammattikorkeakoulu 

Laboratorioalan koulutusohjelma 

LESKINEN, SOJA: 

Spektrikirjaston luominen nestekromatografi-massaspektrometrille 

Opinnäytetyö 69 s., liitteet 11 s. 

Marraskuu 2010 

_______________________________________________________________ 

Opinnäytetyö tehtiin Kemfine Oy:n laadunvalvontalaboratoriossa Kokkolan toimipisteessä. 

Opinnäytetyön tarkoituksena oli luoda spektrikirjasto nestekromatografi-massaspektrometrille 

Kemfine Oy:n 14 nykytuotannossa olevasta tuotteesta 

sekä laatia ohjeistus spektrikirjaston käytöstä laitteen tuleville käyttäjille. 

Tarkoituksena oli myös vertailla kahta eri ionisaatiotekniikkaa ja erilaisia eluenttikoostumuksia 

sekä tutkia sitä miten erilaiset tekijät vaikuttavat tuotteiden ionisoitumiseen 

ja massaspektreihin. 

Opinnäytetyön kokeellisessa osuudessa laadittiin menetelmät nestekromatografille 

ja massaspektrometrille ja analysoitiin tuotteet käyttäen kahta eri ionisaatiotekniikkaa: 

sähkösumutusionisaatiota (Electrospray Ionization, ESI) ja ilmanpaineista 

kemiallista ionisaatiota (Athmospheric Pressure Chemical Ionization, 

APCI). Lisäksi tutkittiin fragmentorijännitteen vaikutusta tuotteiden ionisoitumiseen 

ja kokeiltiin eluentteina metanolia ja asetonitriiliä. 

Laaditut menetelmät sekä nestekromatografille että massaspektrometrille osoittautuivat 

onnistuneiksi, koska kaikki tuotteet yhtä lukuun ottamatta saatiin ionisoitumaan 

käytetyillä parametreilla. Tuloksien perusteella pääteltiin, että näillä 

parametreilla kyseiset tuotteet ionisoituvat paremmin APCI-tekniikalla. Lisäksi 

tuotteiden käyttäytymisestä erilaisissa ajo-olosuhteissa saatiin arvokasta informaatiota 

yritykselle jatkotutkimuksia ja menetelmänkehitystä varten. 

Tulevaisuudessa olisi hyvä jatkaa tutkimuksia vielä menetelmän kehityksen parissa 

ja kiinnittää huomiota esimerkiksi ESI- ja APCI-tekniikan samanaikaiseen 

käyttöön. Myös selvityksiä metanolin kanssa olisi syytä jatkaa, koska opinnäytetyötä 

tehdessä kävi ilmi, että metanoli toimii eluenttina tällä laitteella paremmin 

kuin asetonitriili. 

_______________________________________________________________ 

Asiasanat: korkean erotuskyvyn nestekromatografia, massaspektrometria, ESI, 

APCI, massaspektri, spektrikirjasto 

2

ABSTRACT 

Tampere University of Applied Sciences 

Degree Programme in Laboratory Sciences 

LESKINEN, SOJA: 

Creating spectral library for liquid chromatograph-mass spectrometer 

Bachelor’s thesis 69 pages, appendix 11 pages 

November 2010 

______________________________________________________________ 

This Bachelor’s thesis was made at the quality control laboratory of Kemfine 

Kokkola. The purpose of this Bachelor’s thesis was to create a spectral library 

for high performance liquid chromatograph-mass spectrometer (HPLC-MS) from 

14 chemicals now in production and write instructions for the future operators of 

the instrument. The aim of the thesis was also to compare different ionization 

techniques and eluent formulas. In addition, the different parameters of the instrument’s 

run conditions were explored and how they affect ionization and 

mass spectrums. 

In the experimental part of this thesis, methods were created for HPLC and 

mass spectrometer. After that, products were analyzed using two different ionization 

techniques: electrospray ionization, ESI, and athmospheric pressure 

chemical ionization, APCI. The influence of fragmentor voltage was examined 

and also methanol and acetonitril were tried as eluents 

Methods that were developed for HPLC and mass spectrometer were successful. 

All products except one ionized well with the parameters used. Based on the 

results of this thesis, it was concluded that these products ionized better when 

APCI-technique was used. Valuable information on the behavior of these products 

under different conditions was received for future method development. 

In the future it would be important to continue studies with method development 

and pay attention to using ESI- and APCI techniques together at the same time. 

Researches with methanol should also continue to be carried out, because it 

occurred that methanol would be better eluent than acetonitril for this instrument. 

_____________________________________________________________ 

Keywords: HPLC, mass spectrometer, ESI, APCI, mass spectrum, spectral library 

3

SISÄLLYS 

1 JOHDANTO ..................................................................................................... 6 

2 NESTEKROMATOGRAFIA.............................................................................. 7 

2.1 HPLC-laitteisto .......................................................................................... 8 

2.1.1 Eluentit ................................................................................................ 9 

2.1.2 Pumppu .............................................................................................. 9 

2.1.3 Injektori ............................................................................................. 10 

2.1.4 Kolonni .............................................................................................. 10 

2.1.5 Detektori ........................................................................................... 11 

2.2 HPLC-menetelmän kehitys ...................................................................... 12 

2.2.1 pH ..................................................................................................... 12 

2.2.2 Isokraattinen ja gradienttiajo ............................................................. 13 

2.2.3 Lämpötila .......................................................................................... 14 

2.2.4 Virtaus ja paine ................................................................................. 15 

3 MASSASPEKTROMETRIA ............................................................................ 16 

3.1 MS-laitteisto ............................................................................................. 16 

3.1.1 Näytteen ionisaatio ........................................................................... 17 

3.1.2 Ionioptiikka ........................................................................................ 22 

3.1.3 Massa-analysaattori .......................................................................... 23 

3.1.4 Detektori ........................................................................................... 24 

3.2 Menetelmän kehitys massaspektrometrille .............................................. 24 

3.2.1 Fragmentorijännite ............................................................................ 24 

3.2.2 Polaarisuus ....................................................................................... 25 

3.2.3 Kapillaarin jännite ............................................................................. 25 

3.2.4 Kuivauskaasun virtaus ja lämpötila ................................................... 25 

3.2.5 Sumuttimen paine ............................................................................. 26 

3.2.6 Haihduttajan lämpötila ...................................................................... 26 

3.2.7 Koronaneulan virta ............................................................................ 26 

4 NESTEKROMATOGRAFIN JA MASSASPEKTROMETRIN YHDISTELMÄ .. 27 

5 SPEKTRIKIRJASTO ...................................................................................... 28 

6 TYÖN SUORITUS ......................................................................................... 29 

6.1 Esivalmistelut .......................................................................................... 29 

4

6.1.1 Kolonnin valinta ................................................................................ 29 

6.1.2 Eluentit ja HPLC-laitteen puhdistus................................................... 30 

6.1.3 Näytteiden käsittely ........................................................................... 30 

6.2 HPLC-menetelmä .................................................................................... 31 

6.2.1 Asetonitriili eluenttina ........................................................................ 31 

6.2.2 Metanoli eluenttina ............................................................................ 33 

6.3 MS-menetelmä ........................................................................................ 33 

7 TULOKSET .................................................................................................... 35 

7.1 Massaspektrien kvalitatiivinen tulkinta ..................................................... 35 

7.2 Asetonitriilianalyysien tulokset ................................................................. 37 

7.2.1 ESI-tekniikka asetonitriilianalyyseissa............................................... 37 

7.2.2 APCI-tekniikka asetonitriilianalyyseissa ............................................ 39 

7.2.3 ESI- ja APCI- tekniikan vertailu asetonitriilianalyyseissa ................... 41 

7.3 Metanolianalyysien tulokset ..................................................................... 43 

7.3.1 ESI-tekniikka metanolianalyyseissa .................................................. 44 

7.3.2 APCI-tekniikka metanolianalyyseissa ............................................... 46 

7.3.3 ESI- ja APCI- tekniikan vertailu metanolianalyyseissa ...................... 48 

7.4 Eluenttikoostumuksen vaikutus tuotteiden ionisoitumiseen ..................... 49 

7.5 Fragmentorijännitteen vaikutus tuotteiden fragmentoitumiseen .............. 52 

7.6 Tulosten yhteenveto ................................................................................ 53 

8 PÄÄTÄNTÄ .................................................................................................... 54 

LÄHTEET .......................................................................................................... 55 

LIITTEET .......................................................................................................... 57 

5

1 JOHDANTO 

Opinnäytetyö tehtiin Kemfine Oy:n Kokkolan toimipisteen laadunvalvontalabora- 

toriossa kevään ja kesän 2010 aikana. Kemfine Oy on maatalouskemikaaleja ja 

lääkeaineiden välituotteita tuottava kansainvälinen yritys. Kemfinella on pitkä 

historia kansainvälisessä hienokemikaaliteollisuudessa: orgaanisten hienokemi- 

kaalien valmistus alkoi Kokkolassa jo vuonna 1984 silloisen Kemiran alaisena. 

Kemfinen päämarkkina-alueet ovat Eurooppa ja Yhdysvallat. Kokkolan tehtaan 

laadunvalvonnan laboratoriossa keskitytään lähinnä orgaanisten hienokemikaa- 

lien tuotantoprosessien raaka-aine-, reaktionseuranta-, ja lopputuoteanalytiik- 

kaan. 

Opinnäytetyön tavoitteena oli luoda spektrikirjasto nestekromatografi- 

massaspektrometrille (Liquid Chromatography- Mass Spectrometer, LC-MS), 

johon tallennettaisiin Kemfinen 14 nykytuotannossa olevaa tuotetta sekä laatia 

ohjeistus spektrikirjaston käytöstä laitteen tuleville käyttäjille. Samalla vertailtiin 

kahta eri ionisaatiotekniikkaa ja erilaisia eluenttikoostumuksia. Tarkoituksena oli 

tutkia, miten erilaiset tekijät vaikuttavat tuotteiden ionisoitumiseen ja massa- 

spektreihin, jotta työntekijöiden olisi helpompi jatkaa tutkimuksia ja menetelmän 

kehitystä tulevaisuudessa. 

Ennen tutkimusta LC-MS-laitteella ajettujen yhdisteiden tunnistus oli aikaa vie- 

vää ja tieto esimerkiksi ajoparametreista hajanaista. Tutkimus antaa pohjatietoa 

yhdisteiden tunnistustyön nopeuttamiseksi ja helpottaa ajo-olosuhteiden laati- 

mista. NIST-spektrikirjaston käyttöohje saa työskentelyyn rutiininomaisuutta lait- 

teen tuleville käyttäjille. 

Korkean erotuskyvyn nestekromatografia liitettynä massaspektrometriaan on 

analyyttisen kemian uusinta tekniikkaa, joka yhdistää nestekromatografian ero- 

tuskyvyn ja massaspektrometrian valmiudet tunnistaa lukemattomia yhdisteitä. 

Kemfinelle Agilentin LC-MS-laite hankittiin tammikuussa 2009 ja sitä käytetään 

laboratoriossa lähinnä tuntemattomien epäpuhtauksien tunnistamiseen sekä 

kvalitatiivisiin ja kvantitatiivisiin analyyseihin. 

6

2 NESTEKROMATOGRAFIA 

Kromatografia on tutkimusmenetelmä, jossa näyte jaetaan analyysin aikana 

komponenteikseen tunnistamista varten. Jakautuminen tapahtuu kolonnissa, 

jossa kaksi toisiinsa liukenematonta faasia, stationäärifaasi ja liikkuva faasi, 

ovat vuorovaikutuksessa toistensa kanssa. Nestegromatografiassa liikkuvana 

faasina on neste. Nestekromatografia voidaan jakaa esimerkiksi normaali- ja 

käänteisfaasikromatografiaan sekä ionikromatografiaan, joista käänteisfaasi- 

kromatografia on nykyään käytetyin muoto. (Meyer 2004, 7,14.) 

Näytemolekyylit ovat dynaamisessa tasapainossa faasien välillä eli ne tarttuvat 

toistuvasti stationäärifaasiin ja irtoavat siitä liikkuvaan faasiin. Yhdisteet kulkevat 

eteenpäin kolonnissa liikkuvan faasin mukana. Heikosti stationäärifaasiin tarttu- 

vat yhdisteet etenevät nopeasti, koska ne ovat suurimmaksi osaksi liikkuvassa 

faasissa. Voimakkaasti stationäärifaasiin sitoutuvat yhdisteet kulkeutuvat hi- 

taammin liikkuvan faasin mukana. Eri yhdisteillä on erilainen tasapaino liikkuvan 

ja stationäärifaasin välillä, joten yhdisteet on mahdollista erottaa toisistaan. 

(Meyer 2004, 16-19.) 

Korkean erotuskyvyn nestekromatografiassa liuotin pakotetaan korkean pai- 

neen avulla tiukkaan pakatun kolonnin läpi, joka mahdollistaa yhdisteiden erot- 

tumisen korkealla resoluutiolla (Harris 2007, 556). Korkean erotuskyvyn neste- 

kromatografiaa (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) käytetään 

sekä epäorgaanisten että orgaanisten yhdisteiden analysoimiseen. Tekniikka 

mahdollistaa muiden kromatografisten menetelmien tavoin monen yhdisteen 

samanaikaisen analysoinnin. Lisäksi nestekromatografian avulla voidaan analy- 

soida suurikokoisia orgaanisia molekyylejä. Periaatteessa ainoa edellytys nes- 

tekromatografian käyttämiselle on se, että näyte saadaan liukenemaan johonkin 

liuottimeen. Käytännössä voi ilmetä muitakin ehtoja, kuten sopivan detektrorin 

puute tai näytteen ja liuottimen välinen analysointia haittaava reaktio. (Jaarinen 

& Niiranen 2005, 153.) 

7

2.1 HPLC-laitteisto 

LC-MS-yhdistelmän nestekromatografiosa koostuu injektorista, liuotinpumpusta, 

kolonnista ja detektorista sekä näitä yhdistävistä kapillaareista. Pieni määrä 

näytettä syötetään injektorin kautta korkean paineen alaisena olevaan, kapeissa 

kapillaareissa liikkuvaan nestefaasiin. Näyte siirtyy eluentin mukana kolonniin, 

joka on pakattu tiukasti pienikokoisilla partikkeleilla, stationäärifaasilla. Eluentti 

kulkee tasaisena virtana tiiviisti pakatun kolonnin läpi, joka mahdollistetaan syk- 

keettömästi pumppaavan pumpun avulla. Kulkiessaan kolonnin läpi eluentin 

mukana, näyte jakaantuu komponenteikseen, jotka tulevat vuorollaan ulos ko- 

lonnista detektorille. Detektori mittaa yhdisteen antamaa signaalia ajan funktio- 

na, jolloin saadaan kromatogrammi. (McMaster 2005, 9; Jaarinen & Niiranen 

2005, 154.) 

KUVIO 1. HPLC-laitteisto (Opetushallitus 2004) 

8

2.1.1 Eluentit 

Tavallisesti eluentti koostuu vähintään kahdesta komponentista. Niiden välistä 

suhdetta muuttamalla etsitään analyysiolosuhteet, joissa saadaan näytteen yh- 

disteille paras erotuskyky. Käytettäessä C-18-kolonnia eluenttien tulee olla poo- 

lisia, koska kolonnin stationäärifaasi on pooliton. Näissä olosuhteissa poolisim- 

mat näytekomponentit eluoituvat ensin, joten eluentin poolisuuden lisääminen 

kasvattaa neutraalien yhdisteiden retentioaikaa. (Jaarinen & Niiranen 2005, 

161.) Tyypillisimpiä eluentteja käänteisfaasikromatografiassa ovat hapotettu ve- 

si, metanoli ja asetonitriili. 

Käytettäessä poolisia eluentteja, monet näytekomponentit ionisoituvat. Kään- 

teisfaasikromatografiassa ionimuodossa oleva yhdiste kulkee poolisen eluentin 

mukana liian nopeasti eikä erottumista tapahdu. Tämä voidaan estää puskuroi- 

malla eluentin pH sellaiseksi (yleensä 2-8), että yhdiste saadaan neutraaliin 

muotoon. (Jaarinen & Niiranen 2005, 161.) 

2.1.2 Pumppu 

HPLC-laitteiston olennainen osa on pumppu, jonka on pystyttävä pumppaa- 

maan eluenttia pulssittomasti, toistettavasti ja tasaisella virtausnopeudella lait- 

teiston ja kolonnin tuottamaa vastapainetta (n. 200-350 laitteesta riippuen) vas- 

taan. Materiaaliltaan pumput ovat mahdollisimman puhdasta terästä. Yleisimmin 

käytetään resiprookkipumppua, jonka kammiosta edestakaisin liikkuva mäntä 

työntää eluenttia yksitieventtiilin kautta kolonniin. Binääripumpulla voidaan tuot- 

taa hyvin tarkasti kahden liuottimen seoksia ja kvarternääripumpulla jopa neljän 

eluentin seoksia siten, että liuosten tilavuussuhteita voidaan analysoinnin aika- 

na portaattomasti muuttaa. (Meyer 2004, 52-55.) Tässä työssä käytetyssä 

HPLC-laitteessa oli binääripumppu. 

9

2.1.3 Injektori 

Nykyaikaisessa nestekromatografialaitteistossa näyte syötetään suuripainei- 

seen nestevirtaan automaattisen injektorin avulla. Injektorissa oleva ruisku in- 

jektoi halutun määrän näytettä eluointiliuokseen, joka kuljettaa näytteen kolon- 

niin. (Jaarinen & Niiranen 2005, 165.) 

Näytteen syöttäminen kolonniin on yksi tärkeimmistä asioista HPLC-laitteissa. 

Jopa parhaimmallakin kolonnilla saadaan aikaan huono erotuskyky, jos näytettä 

ei syötetä oikealla tavalla kolonniin: pieni määrä näyteliuosta injektoidaan varo- 

en sammalla, ettei ilmaa pääse kolonniin. Nykyaikaisessa laitteistossa näytteen 

injektoinnista huolehtii automaattinen injektiosysteemi eli autosampleri. (Meyer 

2004, 67.) 

2.1.4 Kolonni 

HPLC-kolonnin tehtävä on erotella näytteessä olevat yhdisteet toisistaan. 

HPLC-kolonnien ulkopinta on valmistettu ruostumattomasta teräksestä ja ne 

ovat tavallisesti 3–30 cm pitkiä. Kolonnin sisähalkaisija on yleensä 2-8 mm ja 

pakkausmateriaalin partikkelikoko on yleensä 3-10 μm. Mitä pienempiä partik- 

kelit ovat, sitä tehokkaampaa on yhdisteiden erottuminen kolonnissa, koska täl- 

löin kolonnin aktiivinen pinta-ala on suuri. (Jaarinen & Niiranen 2005, 154.) Ku- 

viossa 2 on esitetty kolonnin molemmissa päissä olevat huokoiset levyt, fritit, 

jotka pitävät kolonnin sisällä olevan pakkausmateriaalin paikallaan, sekä kar- 

tiotiivisteet, joiden avulla kolonni saadaan tiiviisti liitettyä kapillaariin. (McMaster 

2005, 21.) 

KUVIO 2. HPLC-kolonni (McMaster 2005, 22) 

10

Tässä työssä käytettiin käänteisfaasikromatografiaa, jossa stationäärifaasi on 

pooliton ja eluentit poolisia. Käänteisfaasikromatografiassa kolonni on täytetty 

kemiallisesti sidotulla silikapohjaisella faasilla, jossa suurin osa silikan hydrok- 

syyliryhmistä on korvattu suoraketjuisilla hiilivedyillä tai hiilivetyketjuilla, joissa 

on poolisia substituutioryhmiä. Tyypillisin sidottu ryhmä on oktadekyyliryhmä, 

jolloin vastaava faasi on oktadekyylisilaani, ODS. Oktadekyylisilaania kutsutaan 

usein C-18-materiaaliksi. (Jaarinen & Niiranen 2005, 156.) 

2.1.5 Detektori 

Nestekromatografiassa yleisesti käytettyjä detektoreja ovat UV- (ultraviolet- 

tisäteily), UV/VIS- (näkyvä valo), fluoresenssi-, sähkökemialliset ja taitekerroin- 

detektorit (Refraction Index, RI). UV/VIS-detektori on paras vaihtoehto silloin, 

kun tutkittava yhdiste absorboi UV- tai näkyvän valon aallonpituusalueella, mut- 

ta sitä ei voida käyttää, jos yhdiste ei absorboi UV- tai näkyvää valoa lainkaan. 

Yleensä laitteissa on käytössä diodirivividetektori, jolloin voidaan mitata useita 

aallonpituuksia samanaikaisesti. (Snyder, Kirkland & Glajch 1997, 59-60.) Tai- 

tekerroindetektoria voidaan pitää nestekromatografian yleisdetektorina, mutta 

se on paljon epäherkempi kuin esimerkiksi UV/VIS-detektori ja reagoi herkem- 

min kromatografisen ajon aikana mm. lämpötilan vaihteluille. Massaspektromet- 

ria on myös yksi detektorimuoto nestekromatografiassa ja sen käyttö on koko 

aja yleistymässä. Taulukossa 1 on vertailtu erilaisten detektorien ominaisuuksia. 

Tässä työssä käytetyssä Agilentin HPLC-laitteessa on UV/VIS-diodirividetektori 

sekä laitteesen yhdistettynä massaspektrometri. (Opetushallitus 2004.) 

11

TAULUKKO 1. Nestekromatografialaitteistossa yleisimmin käytettyjen detektori- 

en ominaisuuksia (Opetushallitus 2004) 

Detektori Sovellusalue Lineaarinen alue Gradienttiajo 

Taitekerroindetektori Hyvin laaja 10 4 

Johtokykydetektorit Suppea 10 5 

Ei sovellu 

Huono 

UV/VIS Laaja 10 5 Hyvä 

Fluoresenssi Rajattu 10 4 Hyvä 

Amperometriset detektorit Rajattu 10 6 Huono 

Kulometriset detektorit Rajattu 10 6 Huono 

Johtokykydetektorit Rajattu 10 5 Huono 

Massaspektrometri Laaja Hyvin suuri Hyvä 

2.2 HPLC-menetelmän kehitys 

HPLC-menetelmän kehityksellä on tärkeä rooli analysoitaessa erilaisia yhdistei- 

tä. Huolimatta merkittävästä edistymisestä kromatografisten menetelmien kehi- 

tyksessä ja automatiikassa viime vuosikymmenillä, spesifisen HPLC- 

menetelmän luomiseen tarvitaan vielä paljon tietoa analyysin tekijältä. Mene- 

telmää luotaessa tutkijan täytyy ottaa huomioon monia analyysiin vaikuttavia 

tekijöitä (parametreja), kuten esimerkiksi näytteen ja liuottimen väliset interakti- 

ot, lämpötila, kolonnin ominaisuudet, eluentin virtaus, pH ja paine. (I ym. 2002, 

28.) 

2.2.1 pH 

Käänteisfaasikromatografiassa eluentin pH täytyy usein puskuroida sopivaksi, 

jotta tutkittava yhdiste saadaan neutraaliin muotoon. Muutoin ionina oleva yh- 

diste kulkee poolisen eluentin mukana liian nopeasti kolonnin läpi eikä tarvitta- 

vaa erottumista tapahdu. Käytännössä pH:n muutos saadaan aikaiseksi lisää- 

mällä eluenttiin happoa. (Jaarinen & Niiranen 2005, 157.) LC-MS-analyysissä 

puskurina käytetään orgaanista happoa, esimerkiksi muurahaishappoa, koska 

epäorgaaniset hapot, kuten muutoin yleisesti käytetty fosforihappo, likaavat ioni- 

12

lähteen ja siten huonontavat herkkyyttä ja lopulta hävittävät signaalin kokonaan 

(McMaster 2005, 43). 

2.2.2 Isokraattinen ja gradienttiajo 

Isokraattinen ajo tarkoittaa analyysiä, jossa eluointiliuoksen koostumusta ei 

muuteta ajon aikana. Usein isokraattisella ajolla ei saada näytekomponentteja 

eluoitumaan ulos kolonnista tarpeeksi nopeasti tai komponenttien retentioajat 

menevät päällekkäin. Tällöin voidaan käyttää gradienttiajoa, jossa eluentin 

koostumusta muutetaan ajon aikana. Kuviosta 3 nähdään, että käytettäessä 

isokraattista ajoa, jossa eluentti koostuu asetonitriilistä ja happovedestä (50:50), 

piikit retentoituvat osittain päällekkäin. Jos taas käytettäisiin vettä ja asetonitriiliä 

suhteessa 70:30, analyysiin menevä aika pidentyisi huomattavasti. (Harris 

2007, 565.) 

KUVIO 3. Esimerkki isokraattisen ajon kromatogrammista (Harris 2007, 564.) 

Kuviossa 4 on käytetty gradienttiajoa, eli eluentin koostumusta on muutettu vai- 

heittain kromatografisen ajon aikana. Analyysi on aloitettu ajamalla 8 minuutin 

ajan asetonitriiliä ja happovettä suhteessa 30:70, jolloin piikit 1, 2 ja 3 erottuivat. 

Sitten eluenttien suhdetta on muutettu tasaisesti 5 minuutin ajan siten, että ase- 

tonitriiliä ja happovettä on ollut suhteessa 45:55, jota on ajettu 15 minuuttia piik- 

kien 4 ja 5 tullessa ulos. Lopuksi eluenttisuhdetta on muutettu suhteeseen 

80:20, kunnes viimeisetkin piikit ovat tulleet ulos. Tässä tapauksessa gradient- 

13

tiajolla on saatu nopeampi analyysi kuin isokraattisella ajolla. (Harris 2007, 

565.) 

KUVIO 4. Esimerkki gradienttiajon kromatogrammista (Harris 2007, 565.) 

2.2.3 Lämpötila 

Ei ole mahdollista tehdä yleispäteviä ohjeita siitä, miten lämpötila vaikuttaa 

HPLC-analyysiin. Voidaan kuitenkin sanoa, että kolonnin lämpötila voi vaikuttaa 

erilaisten yhdisteiden retentoitumiseen ja lämpötilan nostaminen saattaakin no- 

peuttaa analyysia. Kuitenkin pH:lla ja eluentin koostumuksella on suurempi vai- 

kutus menetelmän kehityksessä, joten usein lämpötila säädetään vakiomuuttu- 

jaksi. Lämpötilan ollessa vakio, saadaan toistettavampia tuloksia, kun tällä ta- 

voin eliminoidaan esimerkiksi huoneenlämpötilan vaihtelut. (Dolan ym. 1998, 1- 

31.) 

Jos on mahdollista, ihanteellisen erotusmenetelmän saamiseksi kannattaa aina 

kuitenkin tarkistaa lämpötilan vaikutus analyysiin. Joskus menetelmä voi toimia 

paremmin korkeammissa tai matalammissa lämpötiloissa. Esimerkiksi, jos ana- 

lyysoidaan korkean molekyylimassan omaavia yhdisteitä, kuten proteiineja, 

kiinnostuksen kohteena on n. 80ºC lämpötilat. (Meyer 2004, 45.) 

14

2.2.4 Virtaus ja paine 

Eluentin virtausnopeus on yleensä säädettävissä 0,1 ml/min välein 15 ml/min 

nopeuteen saakka. Tyypillinen eluentin virtausnopeus on kuitenkin 1 ml/min. 

Laitteiston paineeseen vaikuttavia tekijöitä ovat mm. virtausnopeus, eluentin 

viskositeetti, kolonnin pituus ja täytemateriaali sekä lämpötila. (Jaarinen & Nii- 

ranen 2005, 162-163.) 

15

3 MASSASPEKTROMETRIA 

Massaspektrometri (Massspectrometer, MS) on herkkyytensä ansiosta tehok- 

kain detektori kromtografialaitteisiin ja sitä käytetään sekä kvalitatiivisissa että 

kvantitatiivisissa tutkimuksissa. Massaspektrometrian avulla voidaan tunnistaa 

eri yhdisteitä, vaikka niillä olisi sama retentioaika. (Harris 2007, 474.) Massa- 

spektrometri onkin tyypillisesti kytketty kromatografiin, jolloin yhdisteiden erotte- 

lu ja kromatografinen analyysi tukevat massa-analyysia (Jaarinen & Niiranen 

2005, 122). 

Massaspektrometria on tutkimusmenetelmä, jolla tutkitaan massaspektristä yh- 

disteiden massoja (Harris 2007, 474). Massaspektri antaa kuvan molekyylin ra- 

kenteesta ja spektrin pohjalta yhdiste on mahdollista tunnistaa (Jaarinen & Nii- 

ranen 2005, 122). Massaspektrin saamiseksi yhdisteet ionisoidaan ja fragmen- 

toidaan, jonka jälkeen saadut ionit kiihdytetään sähköiseen kenttään ja erotel- 

laan niiden massa-varaussuhteen (m/z) mukaan (Harris 2007, 474). 

Käytännössä yhdisteiden tunnistus tapahtuu vertaamalla mitattua massaspekt- 

riä kirjastospektriin, jolloin tuntemattoman näytteen analysointi tapahtuu auto- 

maattisesti (Jaarinen & Niiranen 2005, 122). LC-MS:lle valmista spektrikirjastoa 

Kemfinen tuotteista ei ole olemassa, joten sellainen täytyy luoda itse. 

3.1 MS-laitteisto 

Kun näytteen sisältämät yhdisteet on ensin eroteltu nestekromatografilla, ne 

siirretään massaspektrometrille analysoitavaksi. Massaspektrometrille siirtyvät 

analysoitavien komponenttien lisäksi eluentti sekä muutkin haihtuvat reagenssit. 

Liuotin ja muut analyysissä käytetyt reagenssit täytyy poistaa systeemistä tässä 

vaiheessa, jotta vain näytekomponentit siirtyvät analysoitavaksi. (McMaster 

2005, 51.) 

16

Massaspektrometria perustuu vakuumin läpi kulkevien ionien erittelyyn ja tar- 

kasteluun. Erittelyn tuloksena saadaan massaspektri, joka antaa tietoa yhdis- 

teen molekyylimassasta, rakenteesta, määrästä ja puhtaudesta. Massaspekt- 

rometri soveltuu sekä kvantitatiivisiin että kvalitatiivisiin analyyseihin. (Agilent 

Technologies 2007, 10.) 

KUVIO 5. Kaaviokuva massaspektrometrista (Opetushallitus 2004) 

Kuviossa 5 on näytetty pelkistetty kaaviokuva massaspektrometrista. Näyte 

johdetaan HPLC-laitteesta ionisaatiokammioon, jossa tapahtuu näytteen ioni- 

saatio normaalissa ilmanpaineessa. Syntyneet ionit kulkevat kapillaarin ja usei- 

den eri ionioptisten osien, kuten skimmerin ja oktopolin, läpi massa- 

analysaattoriin, joka erottelee ionit. Analysaattorista ionit kulkevat detektorille, 

joka rekisteröi kunkin ionin lukumäärän ja massan. Kun ionit siirtyvät lentoradal- 

la ionisaatiokammiosta detektorille, laitteen sisäinen paine pienenee vaiheittain 

ilmanpaineesta (760 torr) vakuumipaineeseen 10 -6 torr. (Agilent Technologies 

2007, 10–12.) 

3.1.1 Näytteen ionisaatio 

Yleisimmät HPLC:n liitäntäsysteemit massaspektrometriin ja ionisaatiomene- 

telmät LC-MS:lla ovat sähkösumutusionisaatio (Electrospray Ionization, ESI) ja 

ilmanpaineinen kemiallinen ionisaatio (Atmospheric Pressure Chemical Ionizati- 

17

on, APCI). Uusimpana tekniikkana on ilmanpaineessa tehtävä fotoionisaatio 

(Athmospheric Pressure Photo Ionization, APPI). APPI:n käyttö on toistaiseksi 

hyvin vähäistä, mutta se saattaa yleistyä tulevaisuudessa. APCI- ja ESI- 

ionisaatiota kutsutaan pehmeiksi ionisointitekniikoiksi, koska niiden avulla on 

mahdollista analysoida kokonaisia yhdisteitä vähäisen fragmentoitumisen takia. 

(Hämäläinen & Turpeinen 2006, 25; Harris 2007, 488.) Työssä käytetyssä Agi- 

lentin 6120 Quadrupole MS-yksikössä on molemmat, ESI- ja APCI-tekniikka, 

joten niiden teoriaa on käsitelty lähemmin seuraavaksi. 

Sähkösumutusionisaatiossa nestekromatografialiuos johdetaan yhdessä kuiva- 

uskaasun (N2) kanssa ruostumattomasta teräksestä valmistetun sumutusneulan 

kautta ionisaatiokammioon, jossa on vahva sähkökenttä. Kuivauskaasun ja 

sähkökentän vaikutuksesta neulasta sumutetusta nesteestä muodostuu hieno- 

jakoinen aerosoli, joka koostuu varautuneista pisaroista. (Niessen 2003, 415.) 

Varautuneet pisarat pienenevät liuottimen haihtuessa ja pisaroiden varaustiheys 

kasvaa niin suureksi, että sähköinen poistovoima voittaa pisaroiden pintajänni- 

tyksen ja ne hajoavat vielä pienemmiksi korkeasti varautuneiksi aerosolihiukka- 

siksi (kuvio 6) (Jaarinen & Niiranen 2005, 211). 

KUVIO 6. ESI-tekniikka (Gates 2004) 

Kun liuotin on haihtunut, analysoitavan yhdisteen ionit vapautuvat siinä muo- 

dossa, missä ne ovat olleet eluointiliuoksessa. Liuoksessa on voinut muodostua 

esimerkiksi protonoitunut molekyyli, MH + (massa M + 1), tai molekyyliaddukti, 

johon on liittynyt esimerkiksi natriumioni, MNa + (massa M + 23), jotka näkyvät 

massaspektrissä. ESI-tekniikalla voidaan luoda sekä positiivisia että negatiivisia 

18

ioneja lähinnä sen mukaan, ovatko molekyylit protonin luovuttajia vai vastaanot- 

tajia. (Jaarinen & Niiranen 2005, 211.) 

Muodostuneet näyteionit kulkeutuvat kapillaarin kautta eteenpäin massa- 

analysaattorille ja haihtunut liuotin ajautuu pumpun avulla ulos systeemistä (Agi- 

lent Technologies 2007, 24). Sähkösumutusionisaatio (ESI) soveltuu parhaiten 

yhdisteille, jotka ovat liuoksessa ioneina. Sillä voidaan kuitenkin ionisoida myös 

neutraaleja yhdisteitä, jos eluenttiin lisätään puskuria. ESI:llä voidaan analysoi- 

da yhtä hyvin positiivisia kuin negatiivisiakin ioneja. (Hämäläinen & Turpeinen 

2006, 25.) Sähkösumutusionisaatio on käytännöllinen analysoitaessa erityisesti 

suuria yhdisteitä, kuten proteiineja, mutta sitä voidaan käyttää myös pienemmil- 

le yhdisteille, esimerkiksi pestisideille ja lääkeaineille. 

Yhdisteet, jotka eivät ionisoidu tehokkaasti ESI:llä, saadaan usein ionisoitu- 

maan APCI:llä. Se soveltuu parhaiten melko pienille ja stabiileille sekä neutraa- 

leille molekyyleille. (Hämäläinen & Turpeinen 2006, 25.) Ilmanpaineinen kemi- 

allinen ionisaatio, APCI, tapahtuu kaasufaasissa, jossa muodostuu uusia ioneja 

apukaasun (N2) ja höyrystyneen eluentin reagoidessa näytemolekyylien kanssa. 

APCI:ssa, nestekromatografialiuos ajetaan lämmitetyn (350-500 o C) sumutus- 

neulan läpi ionisaatiokammiossa sijaitsevalle korkeajännitteiselle koronaneulal- 

le. (Niessen 2003, 416.) Koronaneulan ympärille muodostuu varautuneita par- 

tikkeleita sisältävä reunus. Tässä reunuksessa syntyy elektroneja, jotka törmäi- 

levät sumutusneulasta tulevaan näytesumuun ionisoiden näytemolekyylejä (ku- 

vio 7). Esimerkiksi protonoitu analyytti MH + voi muodostua seuraavalla tavalla: 

N e N 2e 

N 

N 

2 

2 2N2 N4 

N2 

4 

H 

2 

O 

2 

H 

2 

O 

H2 O H2O 

H3O 

2N 

2 

OH 

H O nH O H O H O) 

3 

2 

3 

( 2 

H3 O ( 

H2O) 

n M MH ( n 1) 

H2O 

n 

19

Analyytti M voi muodostaa myös negatiivisen ionin elektronisieppauksella (Har- 

ris 2007, 490–491.): 

M 

e 

M 

KUVIO 7. APCI-tekniikka (Gates 2004) 

Myös APCI-tekniikalla voidaan luoda sekä positiivisia että negatiivisia ioneja lä- 

hinnä sen mukaan, ovatko molekyylit protonin luovuttajia vai vastaanottajia. 

APCI-tekniikalla saadaan luotua yhdenarvoisia ioneja, joten se soveltuu hyvin 

lukuisille molekyyleille lukuun ottamatta proteiineja. (Harris 2007, 490–491.) 

Agilentin 6120 Quadrupole MS-yksikössä ESI- ja APCI-tekniikkaa on mahdollis- 

ta käyttää myös samanaikaisesti yhdistetyllä ionisaatiolla (Multimode Ionization, 

MMI). MMI-tekniikka on käytännöllinen tutkittaessa tuntemattomia yhdisteitä, 

joista ei voida varmuudella tietää, ionisoituvatko yhdisteet ESI- vai APCI- 

tekniikalla. Tämänkaltaisissa tapauksissa MMI-tekniikka on paras vaihtoehto, 

koska tällöin näytteitä ei tarvitse analysoida kahteen kertaan. Haittapuolena 

MMI-tekniikalla analysoitaessa on se, että laitteen herkkyys kärsii. (Agilent 

20

Technologies 2007, 29.) Tässä työssä näytteet analysoitiin erikseen sekä ESI- 

että APCI-tekniikalla, koska yksi opinnäytetyön kohde oli tutkia nimenomaan 

sitä, että mikä ionisaatiotekniikka on paras kullekin yhdisteelle. 

Kuviossa 8 on esitetty Agilentin 6120 Quadrupole MS-yksikön MMI- 

toimintaperiaate. Ensimmäiseksi tapahtuu sähkösumutusionisaatio varautuneen 

elektrodin avustuksella. ESI-tekniikalla muodostuneet ionit sekä ionisoitumatto- 

mat näyte- ja liuotinmolekyylit kulkeutuvat kuivauskaasun mukana vastaanotta- 

valle elektrodille, joka luo uuden APCI:lle sopivan sähkökentän. Seuraavaksi jo 

ionisoituneet molekyylit erotetaan ionisoitumattomista näyte- ja liuotinmolekyy- 

leistä. Ionisoitumattomat molekyylit kulkeutuvat koronaneulalle ja ionisoituvat 

APCI-tekniikalla. Lopuksi sekä ESI- että APCI-tekniikalla ionisoituneet molekyy- 

lit kulkeutuvat kapillaarin läpi eteenpäin analysoitavaksi. (Agilent Technologies, 

2010.) 

KUVIO 8. Yhdistetty ionisaatio (Agilent Technologies 2010) 

21

3.1.2 Ionioptiikka 

Ionisaatiokammiossa muodostuneet ionit kuljetetaan elektrostaattisesti kuivaus- 

kaasun ja kapillaarin läpi ensimmäiseen vakuumiosioon, jossa on noin 2 torr 

paine (kuvio 9). Pehmeillä ionisaatiotekniikoilla saadaan yleensä luotua ioneja, 

jotka pysyvät kokonaisina ja antavat tietoa yhdisteen molekyylimassasta. Usein 

tarvitaan kuitenkin yksityiskohtaisempaa tietoa yhdisteen rakenteesta. Tällöin 

ioneja voidaan fragmentoida ensimmäisessä vakuumiosiossa. (Agilent Techno- 

logies 2007, 13.) Fragmentointi tapahtuu siten, että ioneihin johdetaan ylimää- 

räistä energiaa lisäämällä kapillaarin ja skimmerin jännite-eroa, jolloin ne lähte- 

vät törmäilemään systeemissä oleviin neutraaleihin molekyyleihin ja saavat ai- 

kaan ionien fragmentoitumista. Mitä suurempi jännite-ero on kapillaarin ja 

skimmerin välillä, sitä enemmän ionit fragmentoituvat. Prosessi on fysikaalinen 

ilmiö, jota kutsutaan törmäys-indusoiduksi dissosiaatioksi (collision-induced dis- 

sociation, CID). (Niessen 2003, 418.) 

KUVIO 9. Massayksikön vakuumitilat (Agilent Technologies 2007, 12.) 

Lähellä kapillaarin ulostulopäätä on metalliset levyt, skimmerit, joissa on pieni 

reikä. Ionit, jotka kulkevat suuremmalla nopeudella ja ovat painavampia, siirty- 

22

vät reiän läpi eteenpäin. Suurin osa kevyemmistä ioneista, kuten kuivauskaa- 

susta ionisoituneista molekyyleista, kulkevat skimmerien ohitse ja poistuvat sys- 

teemistä pumpun avulla. Skimmerien jälkeen paineen vähentyessä ionit ohjau- 

tuvat oktopolin läpi ja läpäisevät sen jälkeen kaksi fokusoivaa linssiä, josta ne 

siirtyvät neljänteen vakuumiosioon. Oktopolin tehtävä on johdattaa tietyn mas- 

sasuhteen omaavat ionit eteenpäin ja se koostuu varautuneista sauvoista kuten 

varsinainen massa-analysaattori, joka sijaitsee neljännessä vakuumiosiossa 

6x10 -6 torr paineessa. (Agilent Technologies 2007, 13-14.) 

3.1.3 Massa-analysaattori 

Massa-analysaattorin tehtävä on erotella ionit niiden massa-varaussuhteen 

(m/z) perusteella, jonka jälkeen ne siirtyvät detektrorille. Massa- 

analysaattoreista yleisin on kvadrupolianalysaattori, mutta myös mm. ionilouk- 

kua (Ion Trap) ja lentoaika-analysaattoria (Time Of Flight, TOF) käytetään, jos- 

kin vähemmässä määrin niiden kalliimman hinnan takia. (Harris 2007, 484.) 

Kvadrupolianalysaattori koostuu neljästä yhdensuuntaisesta sauvasta, joiden 

tuottama värähtelevä sähkökenttä ohjailee ionien kulkua. Sopivilla vaihto- ja ta- 

sajännitteillä tietyn massa-varaussuhteen omaavat ionit lentävät sauvaston läpi 

ja fokusoituvat detektorille. Muut ionit törmäävät sauvoihin, eivätkä pääse detek- 

torille. (Jaarinen & Niiranen 2005, 125-126.) 

KUVIO 10. Kvadrupolianalysaattori (Gates 2009) 

23

3.1.4 Detektori 

Detektorina massaspektrometrissa toimii elektronimonistin, joka muuttaa ionien 

energian sähköpulssiksi. Elektronimonistimen sisäpintaan törmäävät ionit irrot- 

tavat elektroneja, jotka lentävät monistimen toiselle seinustalle ja törmäävät uu- 

delleen seinämään. Törmäyksessä purkautuu lisää elektroneja, jolloin elektroni- 

en tuottama signaali vahvistetaan ja johdetaan tietokoneelle. Signaali on ver- 

rannollinen analysaattorin läpi tulevien ionien määrään. (Jaarinen & Niiranen 

2005, 128.) 

3.2 Menetelmän kehitys massaspektrometrille 

Massaspektrometrissa on monia ionisoitumiseen vaikuttavia tekijöitä, jotka vaa- 

tivat erilaisia säätöjä riippuen siitä, mitä ionisaatiotekniikkaa käytetään. Sen si- 

jaan esimerkiksi massa-analysaattoriin ja fragmentoriin liittyvät parametrit toimi- 

vat samoilla säädöillä riippumatta ionisaatiotekniikasta. (Fischer & Duncan 

2007, 5.) 

3.2.1 Fragmentorijännite 

Laadittaessa menetelmää massaspektrometrille, tärkeä tekijä on fragmentori- 

jännite. Korkeilla fragmentorijännitteillä törmäys indusoitu dissosiaatio, CID, li- 

sääntyy, jolloin myös yhdisteen fragmentoituminen kasvaa. (Choi & Song 2008, 

1847.) Yhtenä tutkimuksen kohteena tässä työssä oli fragmentorijännitteen vai- 

kutus yhdisteiden massaspektreihein. Fragmentorijännite on parametri, joka ei 

vaikuta yhdisteen ionisoitumiseen. 

Ihanteellinen fragmentorijännite, jolloin massaspektriin saadaan näkyviin sekä 

molekyyli-ioni että fragmentoitumista, riippuu tutkittavan yhdisteen rakenteesta. 

Tästä syystä oikean fragmentorijännitteen löytämiseksi tarvitsee tehdä testiana- 

lyyseja. (Agilent Technologies 2007, 18.) 

24

3.2.2 Polaarisuus 

ESI- ja APCI-tekniikoilla voidaan muodostaa sekä positiivisia että negatiivisia 

ioneja. Hallitseva ionien polaarisuus eli napaisuus riippuu tutkittavan yhdisteen 

kemiallisesta rakenteesta ja liuoksen pH:sta. Koska sekä positiivisia että nega- 

tiivisia ioneja voi muodostua, ionien kuljetusjärjestelmän ja ionioptiikan, erityi- 

sesti kapillaarin polaarisuus määrää, kumpaa ionityyppiä detektoidaan. Työssä 

käytetyllä massaspektrometrilla on mahdollista detektoida sekä positiivisia että 

negatiivisia signaaleja samanaikaisesti. Tämä tapahtuu siten, että systeemi 

säädetään vaihtelemaan polaarisuutta todella nopeasti analyysin aikana. Sig- 

naalien samanaikaisesta detektoinnista on hyötyä tuntemattomien yhdisteiden 

analysoimisessa, koska tieto saadaan yhdellä analyysilla, mutta toiminto vähen- 

tää laitteen herkkyyttä. (Agilent Technologies 2007, 18-19.) 

3.2.3 Kapillaarin jännite 

Kapillaarin jännite on parametri, jota käytetään vain ionien ohjaamiseen eikä 

sillä ole merkitystä ionien muodostumisprosessissa. Yleensä kapillaarin jännit- 

teeksi säädetään 2000 V sekä ESI- että APCI-analyyseissa. (Fischer & Duncan 

2007, 5.) 

3.2.4 Kuivauskaasun virtaus ja lämpötila 

Kuivauskaasuna käytettiin typpeä (N2) ja sen virtaus 5 l/min ja lämpötila 300- 

350 o C toimivat yleensä kummallakin ionisointitekniikalla, mutta molempia para- 

metreja voidaan säätää tarvittaessa. ESI-tekniikalle voidaan säätää korkeampi 

virtaus, koska kuivauskaasun on tarkoitus haihtua kokonaan. Sen sijaan APCI- 

tekniikalla kuivauskaasu toimii yhtenä tekijänä ionisoitumisessa, joten korkeam- 

pi virtaus vähentää ionisaatiota ja voi häiritä signaalin stabiiliutta. (Fischer & 

Duncan 2007, 5.) 

25

3.2.5 Sumuttimen paine 

Sumuttimen paine on riippuvainen nestekromatografin eluentin virtausnopeu- 

desta. ESI-tekniikalla toimii parhaiten 60 psi:n (Pounds per Square Inch) paine, 

jolloin eluenttivirtauksen olisi hyvä olla yhtä suuri tai suurempi kuin 800 μl/min. 

APCI-tekniikalla hyvä lähtöarvo on 30 psi 400 μl/min eluenttivirtauksella. (Fi- 

scher & Duncan 2007, 5.) 

3.2.6 Haihduttajan lämpötila 

Agilentin 6120 Quadrupole MS-yksikön yhdistetyssä ionisaatiokammiossa on 

infrapunasäteilijöitä, jotka aiheuttavat HPLC:sta tulleen liuottimen haihtumisen. 

Infrapunasäteilijöiden aluetta kutsutaan haihduttajaksi. Systeemi seuraa haih- 

duttajan lämpötilaa ja se pysyy aina samana riippumatta liuottimen määrästä 

analyysin aikana. ESI-tekniikalla haihduttajan lämpötila säädetään yleensä 

150 o C:een, koska suhteellisen matala lämpötila auttaa suojelemaan termisesti 

heikkoja molekyyleja. APCI-tekniikka vaatii korkeamman lämpötilan, joka on ta- 

vallisesti 250 o C. (Fischer & Duncan 2007, 6.) 

3.2.7 Koronaneulan virta 

Koronaneula on käytössä vain APCI-tekniikalla. Hyvä lähtöarvo koronaneulan 

virraksi on 4-5 μA, joka toimii hyvin monille yhdisteille. Koronaneulan virtaa voi- 

daan kuitenkin säätää tarvittaessa. ESI-tekniikalla analysoitaessa koronaneula 

kytkeytyy automaattisesti pois päältä. MMI-tekniikalla analysoitaessa ko- 

ronaneulan virraksi säädetään yleensä 2 μA. (Fischer & Duncan 2007, 5.) 

26

4 NESTEKROMATOGRAFIN JA MASSASPEKTROMETRIN YHDISTELMÄ 

Nestekromatografin ja massaspektrometrin yhdistelmää on kehitetty jo 1970- 

luvulta lähtien. Päähuomio keskittyi aluksi ns. ”interface”-ongelmaan eli miten 

saataisiin nestekromatografista tuleva nestemäinen eluentti ja sen mukana tule- 

vat analysoitavat yhdisteet kaasumaisiksi ioneiksi, jotta ne voitaisiin analysoida 

massaspektrometrilla. Tämän asian ratkaiseminen vei yhteensä parikymmentä 

vuotta ja nyt ionilähteeseen liittyvät tekniset ongelmat on suurelta osin selvitetty. 

Uusien ionisaatiotekniikkojen avulla nestekromatografin ja massaspektrometrin 

yhdistelmä (LC-MS) on levinnyt useille analyysialueille, kuten ympäristöanaly- 

tiikkaan, lääkekehitykseen, eläinlääketieteeseen ja yleensä biomolekyylien ka- 

rakterisointiin. LC-MS-yhdistelmässä käytetyin kromatografinen erotusmenetel- 

mä on käänteisfaasikromatografia ja eluentteina vesi, metanoli ja/tai asetonitriili. 

(Hämäläinen & Turpeinen 2006, 25.) 

LC-MS-yhdistelmän avulla voidaan erottaa toisistaan melkein mitä tahansa yh- 

disteitä, jotka liukenevat johonkin liuottimeen. Massaspektrometrilla voidaan 

tunnistaa HPLC:n jo erottamat piikit käyttämällä avuksi jokaiselle molekyylille 

luonteenomaista fragmentoitumismallia. (McMaster 2005, 1.) 

LC-MS-yhdistelmällä voidaan analysoida enemmän erityyppisiä yhdisteitä ver- 

rattuna esimerkiksi perinteisempään kaasukromatografi-massatekniikkaan, kos- 

ka kaasugromatografilla voidaan tutkia vain haihtuvia ja korkeita lämpötiloja 

kestäviä yhdisteitä. LC-MS-tekniikalla voidaan tutkia mm. poolisia, ionimuotoi- 

sia, termisesti stabiileja tai hyvin suuria yhdisteitä, kuten biomolekyyleja, torjun- 

ta-aineita, räjähteitä ja rikosteknillisesti tärkeitä yhdisteitä. (Schreiber, A., Efer, 

J. & Engewald 2000, 411.) Muita yhdistelmätekniikkoja ovat esimerkiksi induk- 

tiivisesti kytketty plasma-massaspektrometri (ICP-MS) ja MS-MS-tekniikat. 

27

5 SPEKTRIKIRJASTO 

Tuntemattomien epäpuhtauksien tunnistaminen näyteyhdisteistä helpottuu 

huomattavasti ja on käyttäjäystävällisempää, kun tunnistuksen apuna käytetään 

spektrikirjastoja. Kuitenkin jo olemassa olevia GC-MS-spektrikirjastoja on mah- 

dotonta käyttää hyväksi LC-MS:lla, koska näillä laitteilla on täysin erilaiset ioni- 

saatio- ja fragmentointitekniikat. Näin ollen on luotava uusi spektrikirjasto LC- 

MS:lle. (Schreiber, Efer & Engewald 2000, 411.) Tässä opinnäytetyössä kirjas- 

ton luomiseen käytettiin National Institute of Standards and Technologyn (NIST) 

valmistamaa tietokantaa NIST Standard Reference Database 1A. 

Vuonna 1901 perustettu National Institute of Standards and Technology (NIST) 

on yhdysvaltalainen kauppaministeriön alainen virasto, jonka tehtävänä on ke- 

hittää ja edistää mittaustekniikoita, standardeja ja tekniikkaa. NIST:n päämaja 

sijaitsee Gaithersburgissa, Marylandissä. (National Institute of Standards and 

Technology 2010.) 

Monet tekijät voivat vaikuttaa massaspektrin rakenteeseen. Merkitystä on esi- 

merkiksi sillä, muodostaako tutkittava yhdiste positiivisen vai negatiivisen mole- 

kyyli-ionin. Massaspektrin rakenteeseen vaikuttavat myös ionisaatiotekniikka, 

fragmentorijännite ja eluenttikoosumus. Tämän vuoksi on hyödyllistä tallentaa 

spektrikirjastoon useita spektrejä kustakin yhdisteestä erilaisissa olosuhteissa. 

(Schreiber, Efer & Engewald 2000, 411.) 

28

6 TYÖN SUORITUS 

Työssä käytettiin Agilentin 1200 sarjan binääripumpulla varustettua HPLC- 

laitetta yhdistettynä sarjan 6120 Single Quadrupole MS-yksikköön. Opinnäyte- 

työn kokeellisessa osuudessa liuosmuotoon käsitellyt näytteet analysoitiin usei- 

ta kertoja LC-MS-laitteella erilaisissa ajo-olosuhteissa. Massaspektrit tallennet- 

tiin spektrikirjastoon ja laadittiin käyttöohje NIST-spektrikirjaston tuleville käyttä- 

jille. 

6.1 Esivalmistelut 

6.1.1 Kolonnin valinta 

Työhön valittiin Agilentin ZORBAX Eclipse XDB-C18 Rapid Resolution HT 

4,6mm x 50mm x 1,8μm kolonni. Kemfinen laboratoriossa käytetään tavallisesti 

25, 15 ja 5 cm kolonneja. Kolonni valittiin siksi, että se on hyvä yleiskolonni mo- 

nien erilaisten yhdisteiden analysoimiseen ja lyhyellä kolonnilla mahdollistettiin 

nopeammat analyysit. Lisäksi HPLC-menetelmän kehitykseen ei tarvinnut käyt- 

tää juurikaan aikaa, koska tutkimus oli kvalitatiivinen ja näyteliuoksissa oli vain 

yhtä tutkittavaa ainetta kerrallaan. Kolonnia oli aikaisemmin käytetty reaktion- 

seurannassa. 

Eclipse XDB-C18 RRHT täytetty kolonni on suunniteltu laitteisiin, joissa on kor- 

kea paine. Kolonni on pakattu korkean erotuskyvyn C-18 mikropartikkeleilla 

käänteisfaasinestekromatografiaa varten. Kolonnissa on käytetty teknologiaa, 

jossa oktadekyylisilaanipartikkelit ovat hyvin tiheästi sitoutuneet (eXtra-Dense 

Bonding, XDB). Oktadekyylipartikkelien koko vaihtelee 1,8 mikrometristä 7,0 

mikrometriin. (Agilent EclipseXDB-C18 RRHT Threaded Column Datasheet. 

2006.) 

Eclipse XDB-C18 RRHT täytetty kolonni on käytännöllinen erityisesti happami- 

en, emäksisten ja muiden korkeasti polaaristen yhdisteiden erotukseen. Kolon- 

29

nin stationäärifaasi on pooliton, joten eluenteiksi sopivat erinomaisesti esimer- 

kiksi metanoli-vesi- sekä asetonitriili-vesi-seokset. (Agilent EclipseXDB-C18 

RRHT Threaded Column Datasheet. 2006.) 

6.1.2 Eluentit ja HPLC-laitteen puhdistus 

Laitteen HPLC-osan letkut puhdistettiin ensin ajamalla milliQ-vettä systeemissä 

ilman kolonnia, koska HPLC:lla oli aikaisemmin ajettu fosforihappo-vesi-seosta 

eikä sitä saanut joutua massaspektrometrille (kts. luku 2.2.1). Tämän jälkeen 

asennettiin kolonni. Kolonnin läpi ajettiin puhdasta asetonitriiliä, jotta aiemmas- 

sa käytössä mahdollisesti jääneet epäpuhtaudet saatiin ulos kolonnista. Samal- 

la tarkistettiin, ettei kolonni vuoda. Työssä käytettiin eluentteina asetonitriiliä, 

metanolia ja milliQ-vettä, johon oli lisätty 0,01 % massaspektrometriaa varten 

puhdistettua muurahaishappoa. 

Työssä käytetyt reagenssit olivat 

Asetonitriili (Merck KGaA, HPLC grade) 

Metanoli (Merck KGaA, HPLC grade) 

Muurahaishappo (Fluka Formic acid puriss.p.a. for mass spectroscopy) 

6.1.3 Näytteiden käsittely 

Näyteliuoksiin käytettiin kunkin tuotteen valmistajan antamaa puhdasta stan- 

dardimateriaalia. Jokaista standardia punnittiin 50 ml:n mittapulloon noin 25 mg 

ja liuotettiin milliQ-asetonitriiliseokseen (1:1). Näin saatiin näyteliuokset, joiden 

pitoisuudet olivat noin 0,5 mg/ml. Sama konsentraatio kaikilla näytteillä takaa 

sen, että tulokset ovat verrattavissa toisiinsa. Taulukossa 2 on näkyvissä tuot- 

teiden ominaisuuksia. 

30

TAULUKKO 2. Työssä analysoitavat tuotteet 

Tuote 

nro 

Molekyylimassa 

(g/mol) 

Monoiso- 

tooppinen 

massa 

(Da) 

Molekyyli-kaava Sulamispiste 

( o C) 

Kiehumis- 

piste ( o C) 

31 

Tiheys 

(kg/dm 3 ) 

P46 285.29 285.10 C16H15NO4 141-142 >263 1.31 

P591 248.68 247.99 C9H9ClO4S 229 403 1.59 

P59 346.71 345.99 C11H10CIF3O5S 155 - 1.77 

P561 166.17 166.06 C9H10O3 145 - - 

P56 409.27 408.06 C19H21BrO5 100 - - 

P38 195.28 195.07 C10H13NOS 87 >280 1.07 

P382 228.38 228.06 C10H16O2SSi 137 250-255 0.5 

P381 170.23 170.04 C8H10O2S -18.5 225 1.14 

P281 236.21 236.01 C9H7F3O2S 192 314 

Hajoaa 

1.62 

P282 302.31 302.06 C14H13F3O2S 57-63 ennen 

kiehumista 

1.36 

P28 359.32 359.04 C15H12F3NO4S 135-136 - 1.42 

P52 288.78 288.11 C15H17ClN4 55-65 202-208 1 

P67 233.65 233.02 C12H8ClNO2 67 174 - 

P06 213.66 213.06 C10H12ClNO2 36-49 256-258 1.29 

6.2 HPLC-menetelmä 

HPLC-menetelmän tavoitteena oli saada luotua vain yksi toimiva yleismenetel- 

mä, jolla kaikki tuotteet saataisiin nopeasti ulos kolonnista ja analyysiajat lyhy- 

eksi. Tuotteiden päällekkäisillä retentioajoilla yms. seikoilla ei ollut tässä työssä 

merkitystä, koska näyteliuoksissa oli vain yhtä tutkittavaa ainetta ja tässä työssä 

keskityttiin enemmän massaspektreihin kuin ihanteellisen HPLC-menetelmän 

kehitykseen. 

6.2.1 Asetonitriili eluenttina 

Tuotteet ajettiin ensin vain HPLC-yksikön läpi, koska haluttiin testata menetel- 

män toimivuutta HPLC:llä rasittamatta massayksikköä turhaan. Ensimmäisessä 

testianalyysissa kokeiltiin isokraattista ajoa: muurahaishapolla hapotettua vettä

ja asetonitriiliä pumpattiin systeemiin samassa suhteessa (50:50) koko analyy- 

sin ajan virtauksella 1 ml/min. Laite säädettiin mittaamaan absorbanssia kahdel- 

la aallonpituudella 230 ja 260 nm, koska tuotteilla voi olla erilaiset UV-spektrit ja 

näkyvyysalueet. Injektointitilavuudeksi säädettiin 2 μl kaikille näytteille, jolloin 

myöhemmin massaspektrometrille saapuva näytteen määrä olisi vakio eli n. 1 

μg. Systeemin lämpötilaksi laitettiin 30 o C, jolloin lämpötila oli kontrolloitu kaikilla 

näytteillä. Näillä parametreilla ajoajaksi tuli 10 minuuttia (taulukko 3). 

TAULUKKO 3. Testiajon parametrit 

Isokraattinen ajo 50% H3O + , 50% ACN 

Detektio UV 260 ja 230 nm 

Injektio 2 μl 

Virtaus 1 ml/min 

Lämpötila 30 o C 

Ajoaika 10 min 

Testiajon jälkeen menetelmää muokattiin muuttamalla isokraattinen ajo gra- 

dienttiajoksi, jossa eluenttien suhteellinen määrä vaihtelee ajon aikana (tauluk- 

ko 4). Gradienttiajoon päädyttiin, koska osa tuotteista ei ehtinyt tulla kolonnista 

ulos ja osa retentoitui liian aikaisin. Muita parametreja ei muutettu. Ana- 

lyysiajaksi gradienttiajolla saatiin 8 minuuttia. Kromatogrammien tarkastelun jäl- 

keen gradienttiajolla tehty analyysi todettiin toimivaksi. 

TAULUKKO 4. ACN-gradienttiajo 

Aika (min) H2O (%) ACN (%) 

0 70 30 

5 0 100 

6 0 100 

6.01 70 30 

Tasaantumisaika 2 min 

32

6.2.2 Metanoli eluenttina 

Metanolia pumpattiin kolonnin läpi n. 1 tunti, jotta HPLC-yksikkö puhdistui ase- 

tonitriilistä. Isokraattinen ajo jätettiin metanolilla testaamatta, koska oli todennä- 

köistä, ettei se toimisi metanolillakaan. Tuotteet ajettiin HPLC:n läpi muutoin 

samoilla ajo-olosuhteilla, mutta virtaukseksi vaihdettiin 0,8 ml/min, koska meta- 

noli loi laitteeseen suuremman paineen. Analyysin gradienttia muutettiin siten, 

että alkugradientti oli 40% metanolia ja 60% happovettä (taulukko 5). 

TAULUKKO 5. MeOH-gradienttiajo 

Aika (min) H2O (%) MeOH (%) 

0 60 40 

5 0 100 

6 0 100 

6.01 60 40 

Tasaantumisaika 2 min 

6.3 MS-menetelmä 

HPLC-menetelmien testauksen jälkeen HPLC kytkettiin massayksikköön ja luo- 

tiin menetelmä massayksikölle. Kaikki tuotteet analysoitiin erikseen sekä ESI:lla 

että APCI:lla ja vertailtiin tuotteiden ionisoitumista kummallakin ionisointiteknii- 

kalla. Massaparametrit määritettiin valmistajan antamien tyypillisten ajo- 

olosuhteiden avulla (taulukko 6). Fragmentorijännitteen vaikutusta massaspekt- 

reihin tutkittiin ajamalla tuotteet fragmentorijännitteellä 70, 120 ja 170 V. Polaa- 

risuus säädettiin mittaamaan sekä positiivista että negatiivista signaalia saman- 

aikaisesti. 

33

TAULUKKO 6. Massayksikön parametrit 

Parametri ESI APCI 

Kuivauskaasun virtaus 13,0 l/min 5,0 l/min 

Kuivauskaasun lämpötila 350 o C 350 o C 

Sumuttimen paine 60 psi 20 psi 

Haihduttajan lämpötila 150 o C 250 o C 

Kapillaarin jännite 2000 V 2000 V 

Koronaneulan virta 0 µA 5,0 µA 

Fragmentorin jännite 70/120/170 V 70/120/170 V 

34

7 TULOKSET 

Tuotteet analysoitiin LC-MS-laitteella erilaisissa ajo-olosuhteissa. Kaikista ioni- 

soituneista tuotteista saatiin useita spektrejä, joista parhaimmat tallennettiin 

NIST-spektrikirjastoon (spektrien tallennus on kuvattu liitteessä 1). Tuotteet 

poikkesivat kemialliselta rakenteeltaan toisistaan ja käyttäytyivät erilailla eri olo- 

suhteissa. Tästä syystä tuloksista oli vaikea vetää yleistä linjaa. Massaspektrejä 

saatiin tuotteista yhteensä yli 200 kappaletta, joten kaikkia spektrejä ei esitellä 

tässä työssä yksitellen työn liiallisen laajenemisen takia. 

7.1 Massaspektrien kvalitatiivinen tulkinta 

Tuotteen ionisoitumisesta LC-MS-laitteella kertoo kokonaisionikromatogrammi 

(Total Ion Chromatogram, TIC), jossa näkyy kaikki ionilähteessä ionisoituneet 

ionit joko positiivisella tai negatiivisella polarisuudella tietyllä ajan hetkellä (Ku- 

vio 11). (Agilent Technologies 2007, 80.) Mitä suurempi piikki TIC- 

kromatogrammissa esiintyy, sitä paremmin tutkittava yhdiste on ionisoitunut. 

Piikin suuruudesta kertoo sen pinta-ala, jonka laite laskee automaattisesti. TIC- 

kromatogrammissa näkyvästä piikistä saadaan otettua yhdisteen massaspektri. 

KUVIO 11. Tuotteen P46 TIC-kromatogrammi 

Nopein tapa tulkita massaspektrejä on verrata niitä tietokoneen avulla kirjasto- 

spektreihin. Tässä tapauksessa kirjastoa oltiin vasta luomassa, joten spektrejä 

tarkasteltiin manuaalisesti. Spektristä haettiin molekyyli-ionia vastaava piikki. 

Molekyyli-ioni tarkoittaa yhdisteestä kokonaisena ionisoitunutta yksittäistä mole- 

35

kyyliä. Molekyyli-ionin massa on positiivisella polaarisuudella otetussa massa- 

spektrissä molekyylin monoisotooppinen massa + 1. Negatiivisella polaarisuu- 

della molekyyli-ionia vastaava piikki on molekyylin monoisotooppinen massa - 

1. Lisäksi tarkasteltiin molekyyli-ionista lohjenneita ioneja eli fragmentteja sekä 

molekyyliaddukteja, joita molekyyli-ioni on mahdollisesti muodostanut esimer- 

kiksi natriumionin kanssa (M + 23). Fragmentoitumisella on merkitystä etenkin, 

jos tutkitaan tuntemattomia yhdisteitä, koska fragmenteista voi päätellä esimer- 

kiksi, mitä funktionaalisia ryhmiä yhdiste sisältää. 

Esimerkiksi onnistuneesta negatiivisesta ionisoitumisesta sekä informatiivisesta 

massaspektristä voidaan ottaa tuote P46. TIC-kromatogrammista kuviossa 11 

voidaan todeta, että piikki on muodoltaan hyvä ja sen pinta-ala on riittävän suu- 

ri. Massaspektrissä (kuvio 12) on näkyvissä fragmentoitumista sekä molekyyli- 

ioni. 

KUVIO 12. Tuotteen P46 massaspektri 

Vertailun vuoksi tarkastellaan tuotteen P381 ionisoitumista. TIC- 

kromatogrammissa (Kuvio 13) ei ole nähtävissä selkeää piikkiä. Piikin puuttumi- 

sesta ja rosoisesta pohjaviivasta voidaan päätellä, että tuote P381 ei ole ionisoi- 

tunut eikä tuotteesta näin ollen saatu massaspektriä käytetyillä parametreilla. 

KUVIO 13. Tuotteen P381 TIC-kromatogrammi 

36

7.2 Asetonitriilianalyysien tulokset 

Tässä osiossa esitellään tulokset, jotka saatiin, kun eluenttina käytettiin ase- 

tonitriiliä (ACN) ja happovettä sekä fragmentorijännitettä 70 V. Erisuuruisten 

fragmentorijännitteiden vaikutuksia massaspektreihin käsitellään myöhemmin. 

Tarkastelun kohteena tässä osiossa on ionisaatiotekniikoiden vaikutus tuottei- 

den ionisoitumiseen ja fragmentoitumiseen, kun eluenttina käytettiin asetonitrii- 

lin ja happoveden seosta. Lisäksi kiinnitetään huomiota polaarisuuteen, eli onko 

hallitseva ionityyppi positiivinen vai negatiivinen. 

7.2.1 ESI-tekniikka asetonitriilianalyyseissa 

Taulukoissa 7 ja 8 on esitetty tutkittavien tuotteiden TIC-kromatogrammien piik- 

kien pinta-alat, kun käytettiin ESI-tekniikkaa. Pinta-alat kertovat kunkin tuotteen 

ionisoitumisesta vallitsevissa ajo-olosuhteissa. Lisäksi taulukoissa 7 ja 8 on in- 

formaatiota tuotteiden fragmentoitumisesta ja adduktien muodostumisesta sekä 

molekyyli-ionin esiintyvyydestä. Yleisesti ottaen voidaan sanoa, että ajo on on- 

nistunut, jos TIC-kromatogrammin piikin pinta-ala on suuri, massaspektristä löy- 

tyy molekyyli-ioni ja fragmentoitumista on havaittavissa. 

37

TAULUKKO 7. ACN-ajot ESI-tekniikalla, positiivinen ionisoituminen 

Tuote 

Monoisotooppinen 

massa (Da) 

ACN ESI 

Pos. pinta-ala 

Fragmentteja 

(kpl) 

Molekyyliioni 

(massa) 

P46 285,1 653044 2 286 3 

P591 247,99 0 - - - 

P59 345,99 24146 15 - 4 

P561 166,06 208864 3 167 4 

P56 408,06 1224834 1 409 - 

P38 195,07 3611634 - 196 3 

P382 228,06 29655 10 - 8 

P381 170,04 0 - - - 

P281 236,01 15494 8 - 5 

P282 302,06 73271 4 303 3 

P28 359,04 25395 7 360 - 

P52 288,11 1898339 - 289 - 

P67 233,02 690439 2 - - 

P06 213,06 210430 4 - 1 

TAULUKKO 8. ACN-ajot ESI-tekniikalla, negatiivinen ionisoituminen 

Tuote 


massa (Da) 

ACN ESI 

Neg. 

pinta-ala 

Fragmentteja 

(kpl) 

Molekyyliioni 

P46 285,1 193457 1 - - 

P591 247,99 708322 1 247 1 

P59 345,99 905877 4 345 - 

P561 166,06 72477 1 165 3 

P56 408,06 51580 14 - 2 

P38 195,07 39396 7 - 11 

P382 228,06 1011957 - 227 - 

P381 170,04 0 - - - 

P281 236,01 1117679 1 235 - 

P282 302,06 517755 - 301 - 

P28 359,04 306827 - 358 - 

P52 288,11 56025 8 - 11 

P67 233,02 24781 7 - 15 

P06 213,06 26107 9 212 23 

Addukteja 

(kpl) 

Addukteja 

(kpl) 

38

Kuviossa 14, joka on tehty taulukoiden 7 ja 8 pohjalta, on selkeästi nähtävissä, 

että tuotteiden P46, P561, P56, P38, P52, P67 ja P06 hallitseva ionityyppi on 

positiivinen, kun taas tuotteet P591, P59, P382, P281, P282 ja P28 ionisoituvat 

paremmin negatiivisiksi ioneiksi. Tuote P381 ei ole ionisoitunut lainkaan. 

Milj. ACN ESI Pos. pinta-ala 

6 

ACN ESI Neg. pinta-ala 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

P46 P591 P59 P561 P56 P38 P382 P381 P281 P282 P28 P52 P67 P06 

KUVIO 14. Tuotteiden ionisoituminen ESI-tekniikalla, ACN eluenttina 

7.2.2 APCI-tekniikka asetonitriilianalyyseissa 

Taulukoissa 9 ja 10 on kuvattu tutkittavien tuotteiden TIC-kromatogrammien 

piikkien pinta-aloja, kun käytettiin APCI-tekniikkaa. Taulukoista 9 ja 10 sekä ku- 

viosta 15 voidaan todeta, että tuotteet P591 ja P59 eivät ole muodostaneet lain- 

kaan positiivisia ioneja, mutta negatiivista ionisoitumista on tapahtunut. Tuote 

P381 ei ole ionisoitunut ollenkaan. Tuote P67 muodostanut runsaasti positiivisia 

fragmentteja, mutta positiivista molekyyli-ionia ei ole. Negatiivinen ionisoitumi- 

nen on ollut parempaa ja molekyyli-ioni on muodostunut, mutta fragmentoitu- 

mista ei ollut havaittavissa. P06 on muodostanut positiivisia ioneja heikosti. 

39

TAULUKKO 9. ACN-ajot APCI-tekniikalla, positiivinen ionisoituminen 

Tuote Monoisotooppinen 

massa (Da) 

ACN 

APCI 

Pos. 

pinta-ala 

Fragmentteja 

(kpl) 

Molekyyliioni 

(massa) 

P46 285,1 3001600 2 286 2 

P591 247,99 0 - - - 

P59 345,99 0 - - - 

P561 166,06 648121 2 167 - 

P56 408,06 4626296 2 409 - 

P38 195,07 4913346 - 196 2 

P382 228,06 82664 6 - 1 

P381 170,04 0 - - - 

P281 236,01 0 - - - 

P282 302,06 507729 2 303 - 

P28 359,04 122822 9 360 1 

P52 288,11 4026886 - 289 - 

P67 233,02 115946 12 - 1 

P06 213,06 147552 3 - - 

Addukteja 

(kpl) 

TAULUKKO 10. ACN-ajot APCI-tekniikalla, negatiivinen ionisoituminen 


massa (Da) 

ACN 

APCI 

Neg. pinta-ala 

Fragmentteja 

(kpl) 

Molekyyliioni 

(massa) 

P46 285,1 230650 3 - - 

P591 247,99 2802016 2 247 2 

P59 345,99 3115755 3 345 1 

P561 166,06 283144 1 165 - 

P56 408,06 0 - - - 

P38 195,07 0 - - - 

P382 228,06 807166 - 227 - 

P381 170,04 29062 - - - 

P281 236,01 2985436 2 235 - 

P282 302,06 4353721 1 302 - 

P28 359,04 3571739 1 358 - 

P52 288,11 94218 1 - 3 

P67 233,02 1205007 - 233 - 

P06 213,06 0 - - - 

Addukteja 

(kpl) 

40

Milj. ACN APCI Pos. pinta-ala 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

ACN APCI Neg. pinta-ala 


KUVIO 15. Tuotteiden ionisoituminen APCI-tekniikalla, ACN eluenttina 

7.2.3 ESI- ja APCI- tekniikan vertailu asetonitriilianalyyseissa 

Kun verrataan APCI- ajojen tuloksia (kuviot 16 ja 17) ESI-tekniikalla ajettuihin 

ajoihin asetonitriilin ollessa eluenttina, voidaan TIC-kromatogrammien piikkien 

pinta-aloista havaita, että tuotteiden ionisoituminen on onnistunut huomattavasti 

paremmin APCI-tekniikalla kuin ESI-tekniikalla. Voidaan tehdä myös huomio, 

että kaikki tuotteet, jotka ovat ionisoituneet ESI-tekniikalla positiivisesti tai nega- 

tiivisesti, ovat ionisoituneet samalla tavoin myös APCI-tekniikalla, mutta pinta- 

alat ovat suuremmat. 

41

Milj. 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

ACN ESI Pos. pinta-ala 

ACN APCI Pos. pinta-ala 


KUVIO 16. Positiivisesti ionisoituneet tuotteet: ESI- ja APCI-tekniikan vertailu 

Milj. 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 




KUVIO 17. Negatiivisesti ionisoituneet tuotteet: ESI- ja APCI-tekniikan vertailu 

42

Ainoa poikkeus on tuote P67, joka on ionisoitunut ESI-tekniikalla positiivisesti, 

mutta APCI-tekniikalla negatiivisesti. Tosin vain APCI-tekniikalla saadussa 

massaspektrissä on saatu näkyviin molekyyli-ioni (kuviot 18 ja 19). Tämä voi- 

daan todeta siitä, että negatiivisesti ionisoituneen tuotteen P67 massaspektrissä 

on piikki kohdassa 233, kun tuotteen monoisotooppinen massa on 233. 

KUVIO 18. Positiivisesti ionisoituneen tuotteen P67 massaspektri ESI-tekniikalla 

KUVIO 19. Negatiivisesti ionisoituneen tuotteen P67 massaspektri APCI teknii- 

kalla 

7.3 Metanolianalyysien tulokset 

Tässä osiossa käsitellään tuloksia, jotka saatiin, kun eluenttina käytettiin me- 

tanolia (MeOH) ja happovettä sekä fragmentorijännitettä 70 V. Myös me- 

tanoliajot tehtiin sekä ESI- että APCI-tekniikalla. Erisuuruisten fragmentorijännit- 

teiden vaikutuksia massaspektreihin käsitellään myöhemmin. Tarkastelun koh- 

teena tässäkin osiossa on ionisaatiotekniikoiden vaikutus tuotteiden ionisoitumi- 

seen ja fragmentoitumiseen sekä positiivinen ja negatiivinen ionisoituminen 

43

7.3.1 ESI-tekniikka metanolianalyyseissa 

Taulukoissa 11 ja 12 sekä kuviossa 20 on esitetty tutkittavien tuotteiden TIC- 

kromatogrammien piikkien pinta-alat, kun käytettiin ESI-tekniikkaa. Taulukosta 

11 on nähtävissä, että tuotteet P591, P381 ja P281 eivät ole ionisoituneet posi- 

tiivisesti lainkaan. Molekyyli-ioni on muodostunut vain tuotteilla P46, P561, P56, 

P282, P28 ja P52. TIC-kromatogrammien piikkien pinta-alat ovat vallitsevissa 

olosuhteissa jääneet varsin pieniksi. 

TAULUKKO 11. MeOH-ajot ESI-tekniikalla, positiivinen ionisoituminen 

Tuote 


massa (Da) 

MeOH 

ESI 

Pos. 

pinta-ala 

Fragmentteja 

(kpl) 

Molekyyliioni 

(massa) 

P46 285,1 1422356 1 286 1 

P591 247,99 0 - - - 

P59 345,99 112676 2 - 2 

P561 166,06 612443 1 167 2 

P56 408,06 1071671 1 409 1 

P38 195,07 2636269 - - 3 

P382 228,06 33983 3 - 7 

P381 170,04 0 - - - 

P281 236,01 0 - - - 

P282 302,06 46436 2 303 2 

P28 359,04 95396 1 360 1 

P52 288,11 1123788 - 289 - 

P67 233,02 312972 1 - 1 

P06 213,06 39949 2 - 4 

Addukteja 

(kpl) 

Taulukosta 12 ja kuviosta 20 voidaan havaita, että MeOH-ajoissa ESI-tekniikalla 

tuotteet P591, P59, P561, P38, P382, P281, P282 ja P28 ionisoituvat paremmin 

ja muodostavat molekyyli-ionin negatiivisesti. TIC-kromatogrammien piikkien 

pinta-alat ovat kuiteinkin jokseenkin pienet. 

44

TAULUKKO 12. MeOH-ajot ESI-tekniikalla, negatiivinen ionisoituminen 

Tuote 


massa (Da) 

MeOH 

ESI 

Neg. 

pinta-ala 

Fragmentteja 

(kpl) 

Molekyyliioni 

(massa) 

P46 285,1 161023 1 - - 

P591 247,99 687284 2 247 1 

P59 345,99 1486667 4 345 1 

P561 166,06 72288 1 165 2 

P56 408,06 56374 - - - 

P38 195,07 106846 3 195 22 

P382 228,06 786149 - 227 1 

P381 170,04 0 - - - 

P281 236,01 1142695 1 235 1 

P282 302,06 451682 - 301 - 

P28 359,04 257620 - 358 - 

P52 288,11 98779 6 - 12 

P67 233,02 62712 4 - 12 

P06 213,06 0 - - - 

Milj. 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

Addukteja 

(kpl) 

MeOH ESI Pos. pinta-ala 

MeOH ESI Neg. pinta-ala 


KUVIO 20. Tuotteiden ionisoituminen ESI-tekniikalla, MeOH eluenttina 

45

7.3.2 APCI-tekniikka metanolianalyyseissa 

Taulukoissa 14 ja 15 on kuvattu tutkittavien tuotteiden TIC-kromatogrammien 

piikkien pinta-aloja, kun käytettiin APCI-tekniikkaa. Taulukosta 14 voidaan huo- 

mata, että positiivisen molekyyli-ionin ovat muodostaneet tuotteet P46, P561, 

P56, P38, P282, P28 ja P52. Tuotteella P28 on havaittavissa huomattavaa 

fragmentoitumista verrattuna muihin tuotteisiin. 

TAULUKKO 14. MeOH-ajot APCI-tekniikalla, positiivinen ionisoituminen 


massa (Da) 

MeOH 

APCI 

Pos. 

pinta-ala 

Fragmentteja 

(kpl) 

Molekyyliioni 

(massa) 

P46 285,1 4568886 3 286 - 

P591 247,99 0 - - - 

P59 345,99 0 - - - 

P561 166,06 3824707 1 167 1 

P56 408,06 4478758 3 409 - 

P38 195,07 5369599 1 196 3 

P382 228,06 152596 1 - 2 

P381 170,04 0 - - - 

P281 236,01 0 - - - 

P282 302,06 527954 - 303 1 

P28 359,04 392939 6 360 1 

P52 288,11 4128242 - 289 - 

P67 233,02 398144 2 - - 

P06 213,06 407003 3 214 - 

Addukteja 

(kpl) 

Taulukosta 15 on nähtävissä, että negatiivisen molekyyli-ionin ovat muodosta- 

neet tuotteet P591, P59, P561, P382, P281, P282, P28, P67 ja P06. Tuotteiden 

fragmentoituminen on kohtalaista. Tuote P06 on muodostanut runsaasti mole- 

kyyliaddukteja. 

46

TAULUKKO 15. MeOH-ajot APCI-tekniikalla, negatiivinen ionisoituminen 


massa (Da) 

MeOH 

APCI 

Neg. pinta-ala 

Fragmentteja 

(kpl) 

Molekyyliioni 

(massa) 

P46 285,1 0 - - - 

P591 247,99 2425470 2 247 3 

P59 345,99 4297636 3 345 2 

P561 166,06 177093 1 165 - 

P56 408,06 0 - - - 

P38 195,07 0 - - - 

P382 228,06 145446 1 227 3 

P381 170,04 0 - - - 

P281 236,01 1643155 1 235 - 

P282 302,06 991093 1 301 - 

P28 359,04 2470707 1 358 - 

P52 288,11 177320 3 - 3 

P67 233,02 946780 2 233 - 

P06 213,06 4657 4 212 13 

Addukteja 

(kpl) 

Kuviosta 21 voidaan havaita, että käytetyillä parametreilla paremmin positiivi- 

sesti ionisoituvilla tuotteilla on huomattavasti suuremmat TIC-kromatogrammien 

pinta-alat. 

Milj. 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

MeOH APCI Pos. pinta-ala 

MeOH APCI Neg.pinta-ala 


KUVIO 21. Tuotteiden ionisoituminen APCI-tekniikalla, MeOH eluenttina 

47

7.3.3 ESI- ja APCI- tekniikan vertailu metanolianalyyseissa 

Kuvioissa 22 ja 23 on havainnollistettu ESI- ja APCI-tekniikan toimivuutta sekä 

positiivisesti että negatiivisesti ionisoituneilla tuotteilla, kun eluenttina käytettiin 

metanolia ja happovettä. Kun verrataan ESI- ajojen tuloksia (kuviot 22 ja 23) 

APCI-tekniikalla ajettuihin ajoihin metanolin ollessa eluenttina, voidaan TIC- 

kromatogrammien piikkien pinta-aloista havaita, että tuotteiden ionisoituminen 

on onnistunut huomattavasti paremmin APCI-tekniikalla kuin ESI-tekniikalla se- 

kä positiivisesti että negatiivisesti ionisoituvilla tuotteilla. Kuvioista 22 ja 23 on 

myös nähtävissä, että tuotetta P381 ei ole edelleenkään saatu ionisoitumaan 

testatuilla menetelmillä. Myöskään tuotteet P67 ja P06 eivät ole ionisoituneet 

kovin hyvin. 

Milj. 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 




KUVIO 22. Positiivisesti ionisoituneet tuotteet: ESI- ja APCI-tekniikan vertailu 

48

Milj. MeOH ESI Neg. pinta-ala 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

MeOH APCI Neg.pinta-ala 


KUVIO 23. Negatiivisesti ionisoituneet tuotteet: ESI- ja APCI-tekniikan vertailu 

7.4 Eluenttikoostumuksen vaikutus tuotteiden ionisoitumiseen 

Kuvioissa 24, 25, 26 ja 27 on havainnollistettu eluenttikoostumuksen vaikutusta 

tuotteiden ionisoitumiseen. Kun tarkastellaan kuvioita tarkemmin, voidaan ha- 

vaita, että tuotteet P591, P56, P38, P382, P281, P282, P28, P52, P67 ja P06 

ovat ionisoituneet paremmin, kun ajoissa käytettiin eluenttina asetonitriiliä. Ai- 

noastaan tuotteet P46, P59 ja P561 ionisoituivat paremmin, kun eluenttina käy- 

tettiin metanolia. Tuotetta P381 ei saatu ionisoitumaan käytetyillä parametreilla 

lainkaan. Todennäköisesti kyseessä on todella helposti hajoava tuote, joka on 

hajonnut jo ennen analysoimista. 

49

Milj. 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

ACN ESI Pos. pinta-ala 



KUVIO 24. Positiivisesti ionisoituneet tuotteet: ACN- ja MeOH-ajojen vertailu 

ESI-tekniikalla 

Milj. 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 


MeOH ESI Neg. pinta-ala 


KUVIO 25. Negatiivisesti ionisoituneet tuotteet: ACN- ja MeOH-ajojen vertailu 

ESI-tekniikalla 

50

Milj. 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

ACN APCI Pos. pinta-ala 



KUVIO 26. Positiivisesti ionisoituneet tuotteet: ACN- ja MeOH-ajojen vertailu 

APCI-tekniikalla 

Milj. 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 



51 

MeOH APCI Neg. Pinta-ala 

KUVIO 27. Negatiivisesti ionisoituneet tuotteet: ACN- ja MeOH-ajojen vertailu 

APCI-tekniikalla

7.5 Fragmentorijännitteen vaikutus tuotteiden fragmentoitumiseen 

Kaikki tuotteet ajettiin fragmentorijännitteillä 70 V, 120 V ja 170 V, koska halut- 

tiin tutkia, miten fragmentorijännitteen muuttaminen vaikuttaa tutkittavien tuot- 

teiden fragmentoitumiseen. Fragmentorijännitteen nostaminen lisäsi selkeästi 

fragmentoitumista kaikilla ionisoituvilla tuotteilla. Etenkin fragmentorijännitteellä 

170 V ja usein myös jännitteellä 120 V molekyyli-ioni hajosi kokonaan eikä nä- 

kynyt spektrissä lainkaan. Fragmentorijännitteen suuruuden vaikutuksesta hyvä 

esimerkki on tuote P56. Massaspektreissä (kuviot 28, 29 ja 30) on nähtävissä 

selkeää fragmentoitumista jännitettä nostettaessa. 

KUVIO 28. Tuotteen P56 massaspektri fragmentorijännitteellä 70 V 



52

7.6 Tulosten yhteenveto 

Taulukossa 16 on esitetty yhteenveto saaduista tuloksista. Saatujen tulosten 

perusteella voidaan todeta, että jatkossa näitä tuotteita tai samankaltaisia yhdis- 

teitä analysoitaessa LC-MS-laitteella olisi hyvä käyttää ionisaatiotekniikkana 

APCI-tekniikkaa tai kokeilla MMI-tekniikkaa. Tuloksien perusteella voidaan sa- 

noa, että positiivinen ja negatiivinen ionisoituminen oli yhdisteestä riippuvainen 

ja näin ollen jatkossakin olisi hyvä käyttää positiivista ja negatiivista detektointia 

samanaikaisesti. Tässä työssä asetonitriili osoittautui selkeästi paremmaksi 

eluentiksi, mutta tutkimuksia metanolin kanssa olisi syytä jatkaa, koska ainakin 

Fischerin ja Duncanin (2007, 3) mukaan asetonitriilillä ei saataisi optimaalisia 

tuloksia. 

TAULUKKO 16. Yhteenveto saaduista tuloksista 

Tuote 

Pos./Neg. 

ionisoituminen 

Ionisaatiotekniikka MeOH/ACN 

P46 POS APCI MeOH 

P591 NEG APCI ACN 

P59 NEG APCI MeOH 

P561 POS APCI MeOH 

P56 POS APCI ACN 



P381 Ei ionisoitunut Ei ionisoitunut Ei ionisoitunut 







53

8 PÄÄTÄNTÄ 

Opinnäytetyön tavoitteena oli luoda LC-MS-spektrikirjasto 14 Kemfinen tuotan- 

nossa olevasta tuotteesta NIST-tietokantaan sekä laatia ohjeistus spektrikirjas- 

ton tuleville käyttäjille. Tavoite toteutui ja lisäksi tuotteiden ionisoitumisesta eri- 

laisissa olosuhteissa saatiin runsaasti informaatiota jatkotutkimuksia varten 

Tutkittavasta 14 tuotteesta kaikki muut saatiin ionisoitumaan paitsi tuotteet 

P381 ja P06. Lopuista tuotteista saatiin useita kelvollisia massaspektrejä, jotka 

tallennettiin NIST-spektrikirjastoon tulevia tutkimuksia varten. NIST- 

spektrikirjaston käyttöohje testattiin kokeneella laborantilla, joka hyväksyi ohjeis- 

tuksen muutaman muutosehdotuksen jälkeen. Käyttöohje on nykyään saatavilla 

työntekijöille, jotka laitetta tulevaisuudessa käyttävät. 

Opinnäytetyöstä saatiin arvokasta informaatiota menetelmän kehitykseen LC- 

MS:lle. Tässä työssä menetelmän laatimiseen käytettiin laitteen valmistajan an- 

tamia yleisiä parametreja, mutta jatkossa olisi vielä hyvä tehdä tutkimuksia lai- 

teparametrien parissa. HPLC-menetelmää tarvitsee vielä kehittää sellaiseksi, 

että se toimii näyteliuoksille, jotka sisältävät useita tutkittavia yhdisteitä. Tällöin 

yhdisteiden piikit eivät saa retentoitua päällekkäin, kuten tällä menetelmällä olisi 

käynyt esimerkiksi tuotteille P591 ja P59. 

Koska työssä käytetyllä massaspektrometrilla on mahdollista detektoida sekä 

positiivisia että negatiivisia signaaleja samanaikaisesti, olisi suositeltavaa käyt- 

tää kyseistä asetusta jatkossakin, etenkin, jos näyte sisältää enemmän kuin yh- 

tä analyyttia. Tämä sen takia, koska positiivinen ja negatiivinen ionisoituminen 

jakautuu suhteellisen tasaisesti tuotteiden kesken. MMI-tekniikkaa ei ehditty 

tässä työssä kokeilla ja olisikin mielenkiintoista tietää, miten paljon laitteen 

herkkyys kärsii, kun ESI- ja APCI-tekniikkaa käytetään samanaikaisesti. 

LC-MS-spektrikirjastoa pyritään jatkossa kartuttamaan uusilla tuotteilla sekä 

tuotteista löytyneillä epäpuhtauksilla. Spektrikirjastoon voidaan tulevaisuudessa 

lisätä myös mm. tuotteiden raaka-aineita ja välivaiheiden yhdisteitä. 

54

LÄHTEET 

Agilent Eclipse XDB-C18 RRHT Threaded Column Datasheet. 2006. USA: 

Agilent Technologies. 

Agilent Technologies. 2007. Agilent 6100 series Quadrupole LC/MS Systems 

Consepts Guide. Germany: Agilent Technologies, Inc. 

Agilent Technologies. 2010. Double Your Productivity with Innovative Source for 

Simultaneous ESI/APCI. Luettu 29.6.2010. 

http://www.chem.agilent.com/enus/newsletters/pharmaanalysis/issue8/pages/g31035.aspx 

Choi, S. & Song, M. 2008. Influence of Fragmentor Voltage and Solvent on 

Negative Ionization Behaviors of Uvinul 3039 Using LC/APCI-MS. Bulletin of the 

Korean Chemical Society 29, 1847-1849. 

Dolan, J.W., Snyder, L.R., Djordjevic, N.M., Hill, D.W., Saunders, D.L., Van 

Heukelem, L. & Waeghe, T.J. 1998. Simultaneous variation of temperature and 

gradient steepness for reversed-phase high-performance liquid chromatography 

method development: I. Application to 14 different samples using computer 

simulation. Journal of Chromatography A 803, 1-31. 

Fischer, S. & Duncan, W. 2007. Optimizing the Agilent Multimode Source. California, 

Santa Clara: Agilent Technologies, Inc. 

Gates, P. 2004. Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI). University of 

Bristol. Luettu 28.6.2010. 

http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/apci-ionisation.html 

Gates, P. 2004. Electrospray Ionisation (ESI). University of Bristol. Luettu 

28.6.2010. 

http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/esi-ionisation.html 

Gates, P. 2009. Quadruple & Triple Quadrupole (QQQ) Mass Analysis. University 

of Bristol. Luettu 29.6.2010. 

http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/quad-massspec.html 

Harris, D. C. 2007. Quantative Chemical Analysis. 7th edition. New York: W. H. 

Freeman and Company. 

Hämäläinen, E & Turpeinen, U. 2006. Steroidien määrittämisestä nestekromatografiatandem-massaspektrometrialla 

(LC-MS/MS). Kliinlab, Suomen Kliinisen 

Kemian Yhdistyksen Jäsenlehti 23 (2), 24-29 

55

I, T-P., Smith, R., Guhan, S., Taksen, K., Vavra, M., Myers, D. & Hearn, M.T.W. 

2002. Intelligent automation of high-performance liquid chromatography method 

development by means of a real-time knowledge-based approach. Journal of 

Chromatography A 972, 27-43. 

Jaarinen, S. & Niiranen, J. 2005. Laboratorion analyysitekniikka. 5. uudistettu 

painos. Helsinki: Edita Publishing Oy. 

McMaster, M.C. 2005. LC/MS A Practical User’s Guide. New Jersey: John Wiley 

& Sons. 

Meyer, V. R. 2004. Practical high-performance liquid chromatography. 4th edition. 

Weinheim: John Wiley & Sons. 

Niessen, W.M.A. 2003. Progress in liquid chromatography-mass spectrometry 

instrumentation and its impact on high-troughput screening. Journal of Chromatography 

A 1000, 413–436. 

National Institute of Standards and Technology. 2010. NIST General Information. 

Luettu 10.7.2010. 

http://www.nist.gov/public_affairs/general_information.cfm 

Opetushallitus. 2004. Laboratorioanalyysit: Massaspektrometria. Luettu 

6.9.2010. 

http://www03.edu.fi/oppimateriaalit/laboratorio/analyysimenetelmat_5- 

5_massaspektrometria.html 

Opetushallitus. 2004. Laboratorioanalyysit: Nestekromatografia. Luettu 

29.6.2010. 

http://www03.edu.fi/oppimateriaalit/laboratorio/analyysimenetelmat_2- 

6_nestekromatografia.html 

Schreiber, A., Efer, J. & Engewald. 2000. Application of spectral libraries for 

high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure ionization mass 

spectrometry to the analysis of pesticide and explosive residues in environmental 

samples. Journal of Chromatography A 869, 411–425. 

Snyder, L., Kirkland, J. & Glajch. 1997. Practical HPLC method development. 

2th edition. Canada: John Wiley & Sons. 

56

LIITTEET 

LIITE 1: NIST-spektrikirjaston käyttöohje 

57

NIST MS-search 2.0 

PIKAOHJE 

LIITE 1: 1 (11) 

Soja Leskinen 

16.6.2010 

58

KIRJASTOHAKU 

LIITE 1: 2 (11) 

1. Nist-kirjaston avaamiseksi täytyy ensin valita ms-spektristä piikki klik- 

kaamalla ensin työkalurivistä piikin alusta ja sitten piikin lopusta 

ja lopuksi valita piikki klikkaamalla . 

2. Seuraavaksi ladataan valittu piikki Nist-kirjastoon klikkaamalla ja 

avataan Nist-kirjasto painamalla . 

59

3. Haussa käytettävän kirjaston voi valita näppäimellä. 

→ Avautuu ikkuna, jossa voi muuttaa kirjastoasetuksia: 

LIITE 1: 3 (11) 

Ikkunasta painetaan Libraries ja valitaan haluttu kirjasto. Kirjastoja voi 

valita myös useampia. Kirjasto valitaan, painetaan Add ja OK. 

60

4. kuvan ikkunat on numeroitu ja selitetty alla: 

1. Speclist-ikkunassa näkyy ladatun spektrin datafile. 

2. Ikkunassa on näkyvissä ladatun piikin spektri. 

3. Ladatun spektrin tiedot. 

LIITE 1: 4 (11) 

4. Tässä ikkunassa voidaan valita, miten ladattua tuntematonta spektriä ja 

ohjelman ehdottamaa spektriä tarkastellaan. Kuvassa on avoinna välilehti 

, jossa ylhäällä näkyy ladattu spektri punaisella ja alhaalla ohjel- 

man ehdottama spektri sinisellä. -välilehdellä ohjelma näyttää vain 

spektrien eroavaisuudet. -välilehdellä ohjelma laittaa spektrit rin- 

nakkain. 

5. Ikkunassa on näkyvissä lista ohjelman ehdottamista yhdisteistä todennä- 

köisyysjärjestyksessä. Samalla yhdisteellä voi olla useita spektrejä, jotka on 

saatu erilaisia parametreja käyttäen. 

6. Ohjelman suurimmalla todennäköisyydellä ehdottama spektri, nimi ja ra- 

kennekaava. 

7. Ohjelman suurimmalla todennäköisyydellä ehdottaman spektrin tiedot. 

61

5. PIKANÄPPÄIMET: 

→ käynnistetään kirjastohaku 

→ haetaan tiettyä rakennekaavaa 

LIITE 1: 5 (11) 

→ tyhjennetään valikko 

→ Kun näppäin on pohjassa, esille tulee vain yksi samalla CAS- 

numerolla varustettu spektri, kun näppäin ei ole pohjassa, näky- 

viin tulee kaikki samalla CAS-numerolla varustetut spektrit. Sa- 

malla CAS-numerolla on tallennettu useita spektrejä, jotka voivat 

olla hyvin samanlaisia. 

Spektrit on luotu eri parametreja käyttäen (esim. APCI/ESI, 

POS/NEG, fragmentorijännitteet 70, 120 ja 170 V) 

62

YHDISTEIDEN TALLENNUS KIRJASTOON 

LIITE 1: 6 (11) 

1. Yhdisteen spektri ladataan samalla lailla kuin kirjastohaussa. Sen jälkeen 

valitaan librarian välilehti. Näkyvissä on ohjelmaan ladattu tuntematon 

spektri. 

PIKANÄPPÄIMET: 

→ kirjastoon tallennettujen spektrien haku 

→ voidaan muokata valittua spektriä 

→ valitun spektrin deletointi 

→ uuden kirjaston luominen 

→ kirjaston deletoiminen 

63

2. Yhdisteen lisääminen kirjastoon: 

Klikataan näppäintä, jolloin avautuu ikkuna: 

LIITE 1: 7 (11) 

64

3. Esimerkki kirjastoon lisäämisestä: 

LIITE 1: 8 (11) 

Name: Automaattisesti nimen kohdalla on datafile, joka voidaan poistaa. Da- 

tafilen tilalle kirjoitetaan yhdisteen nimi, sekä perään lisättynä käytetty io- 

nisointimenetelmä, positiivinen vai negatiivinen, fragmentorijännite, eluentti. 

Olisi suositeltavaa käyttää aina samanlaista nimeämisjärjestelmää aina kir- 

jastoon lisättäessä uutta tuotetta. 

Formula: Yhdisteen molekyyli saadaan suoraan rakennekaavasta paina- 

malla (rakennekaavan lisääminen myöhemmin) 

65

66 

LIITE 1: 9 (11) 

Other Names: Yhdisteen mahdolliset muut nimet seuraavassa järjestykses- 

sä: 

1. Tuotenumero 

2. Muu yleisesti käytetty nimi 

3. IUPAC-nimi 

Comments: Tähän kirjoitetaan, millä menetelmällä yhdiste on ajettu ja mitä 

parametreja on käytetty seuraavanlaisessa järjestyksessä (max. 1000 merk- 

kiä): 

1. Eluentti 

2. Menetelmä 

3. Pääparametrit 

Mol. Weight: saadaan myös painamalla näppäintä 

CAS-number: Yhdisteen CAS-numero 

Peak information: Tässä kohdassa voidaan jättää spektrin piikkejä huomi- 

oimatta valitsemalla kyseinen signaali ja painamalla delete, mutta se ei 

yleensä ole suositeltavaa.

LIITE 1: 10 (11) 

Attach Struct: Tässä kohdassa voidaan lisätä yhdisteen rakennekaava. 

Klikkaamalla avautuu ikkuna: 

Valitsemalla ja klikkaamalla päästään valitsemaan 

mikä tahansa kovalevyllä oleva tiedosto. Jos rakennekaava on piirretty esim. 

ChemScetch-ohjelmalla, se täytyy tallentaa .mol-muotoon, jotta Nist-ohjelma 

pystyy avaamaan sen. (Rakennekaavat mol-muodossaan on tallennettu xxx- 

kansioon) Tiedosto valitaan ja klikataan , jolloin rakennekaava tal- 

lentuu yhdisteen tietoihin. 

Add to library: Kun halutut tiedot on kirjoitettu, painetaan ja tal- 

lennetaan yhdiste haluttuun kirjastoon. 

67

LIITE 1: 11 (11) 

4. Jos halutaan muokata jo valmiiksi kirjastossa olemassa olevaa spektriä, hae- 

taan spektri klikkaamalla alla olevasta ikkunasta, jolloin näkyviin tulee 

valitun kirjaston kaikki spektrit. 

Valitaan haluttu spektri ja klikataan , jolloin avautuu ikkuna: 

Muokataan haluttu tieto ja painetaan Replace. 

68

NIST MS-search 2.0 PIKAOHJE

Transform your PDFs into Flipbooks and boost your revenue!

Delete template?

Save as template ?